光感作前駆体を用いた細菌バイオフィルムの光活性処理

要約

出典: Zhao, K. ほか5-アミノルブリン酸介有光力学療法が黄色 ブドウ球菌 バイオフィルムに与える影響を研究するin vitroモデル。 J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオでは、グラム陽性菌バイオフィルムに対する抗菌効果を評価する光力学療法プロトコルを実演しています。バイオフィルムは4つのグループに分けられます。2つは光感作前駆体、2つはバッファーを受けます。すべて暗闇で培養され、その後赤色光曝露を前駆体処理グループとバッファーのみグループに照射します。活性酸素種は前駆体と光の両方を受け取ったグループでのみ生成され、細菌細胞の死を引き起こします。治療の有効性を評価するために、すべてのグループで生存可能性を比較します。

プロトコル

1. バイオフィルム形成

1. 96ウェルマイクロプレートにおけるバイオフィルム形成
   1. 黄色 ブドウ球菌 株USA300と、-80°Cで保存された3つのバイオフィルム形成臨床株(C1-C3)を回収します。
      注: 臨床株がバイオフィルムを形成する能力はマイクロタイタープレートアッセイによって決定されました。
   2. 細菌を5mLのトリプトン大豆ブロス(TSB)培地に接種し、37°Cで一晩振ってインキュベーターで培養し、定常相まで行います。
   3. 細菌培養液を4,000×gで25°Cで10分間遠心分離し、上清液を廃棄します。ペレットをリン酸塩緩衝塩水(PBS)で再懸浮させ、最終濃度2.0×10⁹ コロニー形成単位(CFU)/mLにします。
      注: 細菌の濃度は光学密度測定とプレートカウントで推定され、1 OD₆₀₀ の懸濁液には1.5 ×^{10 8} CFU/mLが含まれていることが明らかになりました。
   4. 細菌の懸浮液を0.5%グルコースを含むTSB培地で1:200(1.0 ×¹⁰ 7 CFU/mL)に希釈します。細胞培養処理済みポリスチレン96ウェルマイクロプレートの各ウェルに200μLの細菌懸濁液を接種します。
   5. マイクロプレートを37°Cで酸素豊富な環境で24時間静的に培養します。
      注: 成熟バイオフィルム形成の培養期間は菌株によって異なります。これは光動力療法(PDT)実験の前に決定されるべきです。
   6. ウェル内の培地を捨て、マイクロプレートウェルをPBSで優しく3回洗浄し、その後上清液を捨てます。
      注: この工程は、形成されたバイオフィルムを乱さないよう非常に慎重に行うべきです。

2. 光照射

1. 5-アミノルブリン酸(5-ALA)は4°Cの冷蔵庫で保存します。実験前に、5-ALAをPBSで希釈して10 mMにします。
   注意: 5-ALA溶液は実験前に新たに準備されるべきです。
2. 実験群では、マイクロプレートの各ウェルに10 mM ALAを200 μL、または培養皿に2 mLを加えます。皿や皿をアルミホイルで覆い、1時間孵化させます。次に、100 mW/^cm² の光強を持つ発光ダイオード(LED)を1時間照射し、633 ± 10 nmの主波長で360 J/cm² の光線量を実現します。
   注: 光エネルギーをすべての井戸・皿のバイオフィルムに効果的かつ均等に届けるために、光源のピークから井戸/皿までの距離を6.0cmに固定し、実験領域を中心照射面積(10 cm×8 cm)に制限します。結果の再現性を確保するために、実験は同じ室温で行うべきです。LED照射工程では、プレートが日光、室内照明、ランプライトなど他の光源に直接当たるのを避けるため、プレートやアンテナを照射エリアに移動させる前にLEDを点灯させ、光が十分に明るく作業を完了しました。
3. 対照群を設定しました(実験では3つの対照群を設置しました)。
   1. 最初の対照群(ALA-LED-)では、マイクロプレートの各ウェルに200 μLのPBSを加え、または培養皿に2 mLを加えます。皿や皿をアルミホイルで覆い、2時間孵化させます。
   2. 第2対照群(ALA+LED-)では、マイクロプレートの各ウェルに10 mM ALAを200 μL、または培養皿に2 mLを加えます。皿や皿をアルミホイルで覆い、2時間孵化させます。
   3. 第3の対照群(ALA-LED+)では、マイクロプレートの各ウェルに200 μLのPBSを加え、または培養皿に2 mLを加えます。皿や皿をアルミホイルで覆い、1時間孵化させます。次に、360 J/^cm² の光照射を633 ± 10 nmの主要波長でLEDに照射します。
      注: LED照射の段階では、プレートを太陽光、室内照明、ランプライトなど他の光源に直接当てないようにしてください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリプトン醤油スープ(TSB)	オキソイド	CM0129B
SYTO9	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	L7012	LIVE/DEADのBacLightバクテリア生存キット
ヨウ化プロピジウム(PI)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	L7012	LIVE/DEADのBacLightバクテリア生存キット
5-アミノルブリン酸(ALA)	復旦張江バイオファーム	3.1
黄色ブドウ球菌株 USA300			USA 300のリファレンス
黄色ブドウ球菌臨床株(C1-C3)			すべての臨床株は慢性鼻副鼻腔炎患者から分離されました
96ウェルマイクロプレート	コーニング社	3599	透明なフラットボトムのポリスチレンTC処理マイクロプレート、個別にラップ、蓋付き、滅菌済み
エッペンドルフ・マイクロ遠心分離機5417	エッペンドルフ	Z365998 |シグマ
インキュベーター	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	SHKE4000	MaxQ 4000ベンチトップオービタルシェイカー
発光ダイオード(LED)	武漢ヤゲ光学電子技術株式会社	LED-IB