蛍光標識細菌のサンプル調製およびイメージング

要約

出典: Chetrit, D., 他レジ オネラ肺炎菌 のDOT/ICM分泌系の時空間的特徴を解明するために、ライブセルイメージングおよびクライオ電子断層撮影を応用すること。 J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオは蛍光標識病原性細菌の調製とイメージングの実演です。まずアガロースパッドを準備し、接着フレーム内に配置します。蛍光タンパク質を発現する遺伝子組み換え細菌の懸液をパッドに適用し、細胞を固定します。フレームはカバースリップで密封され、顕微鏡で観察して細菌の蛍光画像を撮影します。

プロトコル

注意: L. pneumophila の培養、操作、画像診断に関わるすべての処置は、地域のガイドラインに従い、生物学的安全レベル2の検査室で実施されるべきです。

1. レギオネラ肺炎菌染色体へのsfGFP挿入(アレリック交換および二重選択戦略を用いています)(図1、図2)

1. 遺伝子置換ベクターpSR47S11に以下の配列をクローンします:対象部位の上流1,000 bp、次にsfGFP配列、さらに目的部位の下流1,000 bp(図1)。sfGFP配列はN末端またはC末端のフレーム内に、4〜8個のアミノ酸を含むリンカーを配置する必要があります。得られたベクターを大腸菌DH5αλpirに変換します。その後、100 μg/mLのストレプトマイシンを含む木炭酵母抽出物(CYE)寒天に単一コロニーをストリークし、37°Cで5日間増殖させます(図2)。
2. ストリーク L. pneumophila はCYE寒天ストレプトマイシンを投与し、37°Cで2日間成長します(濃密な部分)。ストリーク 大腸菌 DH5αは、25 μg/mLクロランフェニコールを含むLB寒天上のpRK600ヘルパープラスミド(ヘルパー)で形質転換されました。50 μg/mLカナマイシンを含むLB寒天に大 腸菌 DH5αλpir(ドナー)をストリークします。
3. トリペアレント交配を行う:3株のパッチを選択なしでCYE寒天プレートに重ねて培養し、37°Cで4〜8時間培養し、補助者、ドナー、受主のコロニーを培養します。陰性対照として、ヘルパー+レシピナー株ミックスとドナー+レシピエント株ミックスを同じ期間培養します。
4. 交配反応を500μLのddH_2Oに再懸濁。反応の20μLと50μLの反応を100μg/mLストレプトマイシンおよび10μg/mLカナマイシンを含むCYE寒天にプレートし、37°Cで5日間増殖させます。得られたクローン4つを100μg/mLストレプトマイシンを含むCYE寒天にストリークし、37°Cで5日間増殖させます。
5. 5%ショ糖と100μg/mLのストレプトマイシンを含むCYE寒天に16個のクローンをストリークし、37°Cで5日間増殖させます。次に、これらのクローンを100 μg/mLのストレプトマイシンを含むCYE寒天と100 μg/mLのストレプトマイシンおよび10 μg/mLのカナマイシンを含むCYE寒天に32個をストリークし、37°Cで5日間増殖させます。

2. L. 肺炎菌染色体にsfGFPを統合したクローンの単離

1. CYE-agar-ストレプトマイシンプレート上のカナマイシンに感受性のあるストリーククローンの染色体内へのsfGFPの挿入は、コロニーポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって確認されました。sfGFP遺伝子および関心のある染色体領域に補完的なプライマーを用いて挿入接合部を増幅します。
   1. 10μMプライマー溶液それぞれ0.5 μLと1つのコロニーを混合し、最終体積12.5 μLにし、95°Cで10分間変性させます。氷上で10分間冷やし、2xのPCRマスターミックス溶液12.5 μLを加え、PCR分析を行います。
2. 分離されたコロニーの重いパッチをCYE-アガー-ストレプトマイシンプレート上で37°Cで2日間培養します。抗GFP抗体を用いた免疫ブロットでsfGFP融合の発現レベルと安定性を調べます。

3。 蛍光タグ付けされたDot/ICM成分を用いたL. pneumophilaの生細胞イメージング

1. アガロースパッドの調製
   1. 約30mLの1%低溶度アガロース溶液を水に溶かします。ガラスフラスコで電子レンジで約90秒加熱し、時折回してアガロースが完全に溶けるまで加熱します。
   2. 25 x 75 x 1.1 mmの^{3枚ガラス}スライドの端に2枚の2枚を重ねて置きます。反対側の端には22×22×0.15mm^の3枚のガラススライドを2枚重ねます。
   3. 約1mLの溶融アガロースを2枚の上部ガラススライドの間の中央スライドにピペットで注ぎ込み、さらに25×75×1.1mm^の 3スライドを溶融アガロースの上に置きます。気泡の発生を避けてください。スライドを4°Cで15分間冷ます。
   4. メスやカミソリの刃を使って、パッドを小さな四角形(~5×5 mm²)に優しく切ります。25 x 75 x 1.1^{mm 3}ガラススライドに17 x 28 x 0.25^{mm 3}の両面接着剤を取り付け、スライドに複数のパッドを配置します。
2. 画像取得
   注:以下の手順は、SlideBook 6.0の制御下にあり、ソリッドステート照明器、CCDモノクロカメラ、100倍対物レンズ(1.4の数値絞り)を備えた顕微鏡について説明しています。必要に応じて、プロトコル設定に応じてカスタマイズ可能な適切なハードウェアおよびソフトウェア構成を持つ代替顕微鏡装置を使用してください。
   1. L . pneumophila の重いパッチを1 mLのddH₂Oに溶かし、2〜3 μLの希釈液をパッドにピペットで浸します。接着フレームの上に50×24×0.15mmの³ 枚カバースリップを優しく置きます。
   2. キャプチャウィンドウでNDを180に調整します。ビニングを2×2に調整し、488 nmチャネルを使って500〜1,000 msの間に試料を露光します。同じパラメータでタグのない L. pneumophila をイメージングすることで、蛍光信号の特異性を検証します(図3)。

結果

図1:sfGFPをL. pneumophila染色体 に挿入するために用いられた相同組換えおよび対立遺伝子交換の概説。(A) 接合プラスミドpRK600(IncPプラスミド)、自殺ベクターpSR47Sで形質転換されたドナー大腸菌株、そして受主であるL. pneumophilaとの間で三親交配が行われました。(B) SfGFPをL. pneumophila...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100倍プラン・アポ目標(1.4 NA)	ニコン
エース	シグマ・オルドリッチ	A9758
活性炭	シグマ・オルドリッチ	C5510
アガロースGPG/LMP、低溶度	アメリカンバイオアナリシカル	AB00981
バクト脱水寒天	BD	214010
遺伝子フレーム、1.7x2.8 cm、125 μL	フィッシャー・サイエンティフィック	AB-0578
L-システイン	シグマ・オルドリッチ	C7352
顕微鏡カバースライド 22x22mm	フィッシャー・サイエンティフィック	12-542B
顕微鏡カバースライド 24x50mm	フィッシャー・サイエンティフィック	12-545K
顕微鏡スライド 25x75x1 mm	グローブ・サイエンティフィック	1380
スライドブック 6.0	インテリジェントイメージングイノベーション
スペクトラXライトエンジン	ルメンコア
Taq 2Xマスターミックス	ニューイングランド・バイオラボ	M0270
タイタン・クリオス	サーモフィッシャー・サイエンティフィック
酵母エキス	BD	212750