クロストリジウム・ディフィシル感染のマウスモデルの確立

要約

出典: Winston, J. A. ほか 臨床的に関連性のある クロストリジウム・ディフィシル 株のセフペラゾン処理マウスモデルR20291。 J. Vis. Exp. (2016年)

このビデオは、抗生物質前処理マウスに クロストリジウム・ディフィシル 胞子を接種し、病因および宿主反応の研究のためのマウス感染モデルを構築する手順を示しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手技は、地域の施設動物管理委員会およびJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. クロストリジウム・ディフィシル胞子接種器の調製 とマウスの口腔漏拌

注: C. difficile胞子に感染したマウスは、バイオセーフティレベル2の動物施設に収容されるべきです。

1. 目的の株(この場合はR20291)の C. difficile 胞子株を入手し、4°Cの無菌水中で保存しました。使用前にこの胞子ストックの列挙を決定してください。
2. 胞子ストックの既知濃度(胞子/ml)に基づいて、25μlあたり10⁵の胞子を得るための希望の希釈量を計算します。接種量が実験中の全マウスに接種できるほど(マウス1匹あたり25μl)、接種量の列挙(約30μl)、ピペッティング誤差を考慮します。
3. ボルテックス:元の C. difficile 胞子株。次に、ステップ1.2で計算された元の C. difficile 胞子ストックの体積をスクリューキャップ付きのマイクロ遠心分離機管内の無菌水に再懸浮させます。これをラミナーフローフードで有酸素運動で行います。この希釈された混合物を「胞子接種源」と識別してください。
4. 胞子接種剤を65°Cの水浴に入れ、20分間加熱します。
   注: この工程により、熱処理後に活性化された C. difficile 胞子のみが残ることを保証します。
5. 層流フード内で、加熱した胞子接種器50μlを取り、無菌のマイクロ遠心分離機チューブに入れて嫌気性チャンバーに通します。このサンプルを胞子の列挙に使用してください。
6. 層流フード内で、残りの加熱された胞子接種物を無菌バルブ付きの胃ガベージ針に取り付けた1mlの注射器に注入します。手動シリンジステッパーを使って、マウス同士で正確かつ迅速に繰り返し投与します。使用前にガベージ針に加熱した胞子接種物が充填されていることを確認してください。
   注: マウスごとに新しい無菌ガベージ針は必要ありません。しかし、異なる用量の C. difficile 胞子を投与する場合は、各投与ごとに新しいガベージ針を推奨します。
   注:C. difficile胞子は従来の消毒剤に対して非常に耐性があります。したがって、#62 Perisept 殺虫剤消毒剤のような殺虫剤の使用が必要です。メーカーはC. difficileの胞子を破壊するために2分間の接触時間を推奨しています。
7. 各マウスに25μlの胞子接種剤をガベージします。首と背中の緩んだ皮膚を掴んで頭部を動かさないようにして、優しく拘束します。人差し指を使うと頭部がさらに固定され、食道が伸びます。拘束中に動物が鳴いたり、他の苦痛の兆候を見せたりしないように注意してください。
   注: ガベージによってマウスに与える総体積は体重10ml/kg(0.1ml/10g)を超えてはなりません。
8. マウスを直立したままにし、ガベージ針を優しく口の側面に通します。ガベージ針を口蓋に向け、ゆっくりと食道に差し込みます。
   注: 抵抗がある場合は、ガベージ針が気管内に入っている可能性があるため、前進させるのではなく、すぐに抜き換えるべきです。
9. ガベージ針が食道のほぼ半分まで到達した後、加熱した胞子接種剤25μlを注入し、優しく食道からガベージ針を抜きます。
   注: ガベージ針を強く前進させると、食道や胃の破裂を引き起こすことがあります。したがって、ガベージ針を前進させる際に抵抗が発生した場合は、直ちに抜き換え、再配置するのが最善です。
10. 動物をケージに戻し、咳や呼吸困難の兆候がないか観察してください。これは気管への誤投与や加熱された胞子接種の誤嚥を示す可能性があります。
    注: マウスは抗生物質治療後、 C. difficile に非常に感受性が高まります。したがって、ケージ間の交差汚染を防ぐための予防措置が不可欠です。これは特に抗生物質治療を受けたが挑戦されていないマウスを対照群として管理する際に重要です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
#62 ペリセプト スポリディシアル・ディスカフェクティッククリーナー	SSSナビゲーター	48027	この製品はメーカーの推奨により希釈が必要です
C57BL/6Jマウス	ジャクソン研究所	664	マウスは生後5〜8週目が適しています
2mlマイクロ遠心分離機スクリューキャップ	コーニング	430917