方法論記事

感染マウスモデルの糞便サンプルにおける クロストリジウム・ディフィシル の定量化

2026年3月31日

この記事について

要約

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出典: Winston, J. A. ほか 臨床的に関連性のある クロストリジウム・ディフィシル 株のセフペラゾン処理マウスモデルR20291。 J. Vis. Exp. (2016年)

このビデオは、感染マウスモデルの糞便サンプルから選択培養技術を用いてクロス トリジウム・ディフィシル を定量する方法を示しています。サンプル採取、嫌気処理、連続希釈、コロニー個数の手順を概説し、細菌の定着および宿主-病原体相互作用を評価する。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

動物モデルを含むすべての手技は、地域の施設動物管理委員会およびJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

  1. クロストリジウム・ディフィシル(C. difficile)のサンプルの採取
    注: 糞便や盲腸成分を採取する前に、無菌マイクロ遠心分離機チューブを分析スケールで計量してください。チューブの側面にチューブの重さを記録し、小数点以下4桁(例: 0.9864 g)まで四捨五入します。この重さを「チューブの重り」と呼びます。採取した各サンプルは、無菌の重さを測定したマイクロ遠心分離機チューブに入れるべきです。
    1. マウス糞の無菌採取
    1. 首と背中の緩んだ皮膚を掴んで、頭部を動けなくして優しく拘束します。小指で動物の尾を優しく拘束し、肛門を露出させます。拘束中に動物が鳴いたり、他の苦痛の兆候を見せたりしないように注意してください。
    2. 動物の肛門の真下に無菌の重さのあるマイクロ遠心分離機チューブを置きます。チューブがマウスに直接触れないようにすることが不可欠です。
      1. 動物が排泄する際には、糞便のペレットをチューブに集めます。すべての糞便サンプルが採取されるまで、チューブは室温で保管してください。ネズミが排泄するのに数分かかることもあり、そのため何度も糞を集めようと試みる必要があります。
    3. 糞便入りのチューブを分析スケールで計量してください。チューブの重さを小数点以下4桁(例: 1.0021 g)に切り上げて記録します。得られた重量を「最終管の重量」と呼びます。
    4. 便採取後、便を検体直後に嫌気性チャンバーに移し、細菌の点挙を行います。
  2. C. difficileの細菌列挙
    1. C . difficileで数値化される内容物(糞便)の最終重量を計算してください。「最終チューブの重量」を「チューブの重量」から差し引いて行いました。
    2. 内容物を1:10で1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に希釈し、それに応じて再懸浮します。糞便ペレットの場合は、ピペットの先端で優しくペレットを溶かします。
    3. これらの再懸濁サンプルを室温で嫌気的に30分間培養し、内容物を沈殿させます。
    4. 各サンプルを1倍PBSで連続希釈し、成分物(糞便)あたりのコロニー形成単位(CFU)を列挙します。これを無酸素状態で行ってください。
    5. 無菌技術を用いて、各連続希釈物のうち100μlをタウロコール酸シクローセリンセフォキシチンフルクトース寒天(TCCFA)プレートに移します。滅菌L字型スプレッダーを使い、培地に塗布した希釈液を均等に広げてプレート全体に広げます。希釈の拡散もコロニーの正確な数え方に不可欠です。
    6. プレートを37°Cで24時間無酸素培養します。この時点で、 C. difficile コロニーを列挙して、成分(糞便)あたりのCFUを得ます。 C. difficile の群落は平坦で淡い黄色で、縁が不規則で地面ガラスのような外観をしています。
      注: このプロトコルは、回腸および大腸を含む他のマウス消化管(GI)成分からC . difficile を列挙するために使用できます。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プレートは連続希釈に使用できます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1倍PBSギブコ10010-023 
バクトアガーベクトン・ディキンソン214010TCCFAプレートの一部(下記参照)
バクト・プロテオス・ペプトーンベクトン・ディキンソン211684TCCFAプレートの一部(下記参照)
セフォキシチンシグマC47856TCCFAプレートの一部(下記参照)
2mlマイクロ遠心分離機スクリューキャップコーニング430917 
D-シクローセリンシグマC6880TCCFAプレートの一部(下記参照)
果糖フィッシャーL95500TCCFAプレートの一部(下記参照)
リン酸二水素カリウムフィッシャーP285-500TCCFAプレートの一部(下記参照)
硫酸マグネシウム(無水)シグマM2643TCCFAプレートの一部(下記参照)
Millex-GS 0.22 μmフィルターミレックス-GSSLGS033SSTCCFAプレートのフィルター
リン酸水素二ナトリウムシグマS-0876TCCFAプレートの一部(下記参照)
NaClフィッシャーS640-3TCCFAプレートの一部(下記参照)
PCRプレートフィッシャーブランド14230244 
プラスチック製ペトリ皿コード・ヴァルマークブランド2900 
滅菌プラスチックL字型セルスプレッダーフィッシャーブランド14-665-230 
タウロコレートシグマT4009TCCFAプレートの一部(下記参照)
超純度蒸留水インビトロジェン10977-015 
C57BL/6Jマウスジャクソン研究所664マウスは生後5〜8週目が適しています

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TCCFA

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