マクロファージ受容体と細菌抗原の相互作用を調査するための蛍光ベースアッセイ

要約

出典: バルベロ, A. M., et.al. 免疫受容体SLAMF1と結 核菌 の相互作用研究のための蛍光アッセイ。 J. Vis. Exp. ((2025年)

このビデオでは、マクロファージ受容体と 結核菌 抗原の相互作用を研究するための蛍光ベースのアッセイを実演します。カバースリップ上の蛍光標識抗原はマクロファージタンパク質抽出物とともに培養され、架橋・抗体標識され、重なり合う蛍光信号によって可視化されます。

プロトコル

1. 蛍光顕微鏡による結核菌-SLAMF1の相互作用

1. 細菌-タンパク質架橋
   1. 12mmの丸いカバースリップを、丸い鼻の外科用ピンセットを使って24ウェルの培養プレート(1ウェル1枚)に導入します。
      注: カバースリップは70%エタノールで徹底的に掃除してください。希望すれば、オートクレーブまたはUV光の下で30分間滅菌することも可能です。
   2. カバースリップを400 μLの10 μg/mLポリ-D-リジンを4°Cで一晩培養します。プレートを光から守るためにアルミホイルで覆います。
   3. 翌日、皿を冷蔵庫から取り出し、カバースリップを1mLの水で2回洗います。
   4. カバーを乾かしておきましょう。
   5. Mtb-R Ags 20 μL(2 x 10⁶)を180 μLの1x PBSに希釈します。最後の200μLはカバースリップを完全に覆うのに十分です。
   6. カバースリップをMtb-R Agsと共に37°Cの細胞インキュベーターで1時間キュベートします。
   7. 残った液体は捨て、1mLの1xPBS(リン酸緩衝生理食塩水)で2回洗います。
      注: この段階では、赤色チャネルに対応するフィルターを用いて蛍光顕微鏡でMtb-Rのカバースリップへの適切な接着を確認できます。
   8. ブロッキングバッファー400μL(胎児用牛血清10%)を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に1回、攪拌(シェーカー)で30分間RTを加えます。
   9. ブロッキングバッファー400μLで2回洗います。
   10. 100μLのタンパク質抽出物を1xPBS300μLに希釈して2時間、RTで攪拌(シェーカー)でインキュベートします。
   11. 1%ホルムアルデヒドを1xPBSで希釈した400μLを加えます。RTで攪拌(シェーカー)を15分間培養します。
   12. 水で希釈した0.125Mのグリシン500μLを加えます。RTで攪拌(シェイカー)を使い5分間孵化します。
   13. 1mLの1xPBSで2回洗います。
   14. 2 mMのエチレングリコールビス(スクシニミジルスクシネート)(EGS)を400 μL加え、RTで攪拌(シェーカー)で1時間投与。
   15. ステップ1.1.13を繰り返します
       注: 使用時に試薬を準備することが強く推奨されます。
2. SLAMF1染色
   1. 培養皿の蓋をパラフィンフィルムで包みます。
   2. パラフィンフィルムで覆われたまぶたに、以前に調整された抗SLAMF1一次抗体60μL(希釈1:75)を滴入します。
   3. カバースリップを慎重にプレートから取り外し、曲がった細い先端の手術用ピンセットと針を使ってください。
      注: カバースリップの除去を容易にするために、針をおよそ45°の角度で曲げることができます。
   4. 抗体を含む滴水の上にカバースリップを逆さまにします。暗闇の中でRTで30分間孵化させます。
   5. カバースリップを持ち上げてブロッキングバッファーで2回洗います。
   6. カバースリップを二次抗体を含む新しい滴(1:200希釈)に覆します。暗闇の中でRTで30分間孵化させます。
   7. ステップ1.2.5を繰り返します。
   8. 余分な液体を取り除き、カバースリップをガラススライドの上に置いた取り付け液の滴に取り付けます。
   9. 適切なフィルターを使って蛍光顕微鏡で観察してください。
      注: 無菌環境での作業が推奨されます。ブロッキングバッファーで抗体を希釈します。顕微鏡での観察を妨げる傷を避けるため、カバースリップを慎重に扱ってください。蛍光に適した取り付け液を強く推奨します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Alexa フルオナ488二次抗体	インビトロジェン	A21121	蛍光顕微鏡用
抗SLAMF1一次抗体	バイオレジェンド	306302	蛍光顕微鏡用
アクアポリ/マウント	ポリサイエンス	18606-20	マウンティングメディア
カバースリップ 12mm	HDA	-	顕微鏡による相互作用アッセイのために
EGS	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	21565	架橋治療のために
ホルムアルデヒド	メルク	K47740803613	架橋治療のために
ガラススライド	グラス・クラス	-	顕微鏡による相互作用アッセイのために
グリシン	シグマ	G8898	架橋治療のために
イメージャー.A2	カール・ツァイス	430005-9901-000	Colibri 7照明モジュールを用いた蛍光顕微鏡
ポリ-D-リジン	シグマ・オルドリッチ	A-003-M	カバースリップ処理のために
ロダミンB	シグマ・オルドリッチ	21955	Mのために。結核染色