マイクロガベジを用いたゼブラフィッシュ幼虫感染モデルの開発

要約

出典: Li, J., 他 クロス トリジオイデス・ディフィシルの幼虫ゼブラフィッシュ感染モデルの開発。 J. Vis. Exp. (2020)

このビデオでは、麻酔をかけたゼブラフィッシュの幼虫をアガロースで固定し、トレーサー誘導針を使って病原性細菌を経口注射するマイクロガベージ手術を実演しています。非侵襲的な投与は自然感染を模倣し、細菌の複製、毒素放出、腸上皮損傷の解析を可能にします。

プロトコル

1. ゼブラフィッシュ幼虫のガヴェージ

1. マイクロガベージの針を校正してください。
2. 針の先端の直径を測定するには、鉱物油1滴を添えた針を校正スライドに置きます。先端の直径が30〜40μmで、鈍く滑らかであることを確認しましょう。鋭い針や粗い針は捨てましょう。
   注: 針の鋭い刃は素早く燃やすことで鈍らせることができます。
3. ガヴェッジ溶液を用意してください。
4. 針をマイクロマニピュレーターに装填して取り付けます。
5. マイクロマニピュレーターを調整して針を45°の角度に調整します。
6. ゼブラフィッシュの幼虫に麻酔をかけてください。幼虫の動きが止まったら、パスツールピペットを使ってマイクロガベージ型の溝に移します。
7. ゼブラフィッシュの幼虫に0.8%の低溶けアガロースを滴らせて覆い隠します。幼虫を溝内で45度の角度で直立させ、尾を溝の壁に押し付けて優しく調整します。ヘッドの角度がほぼ同じで、ガベージュ針の角度と一致するようにしてください。マイクロガビッジ型を氷に30〜60秒置き、低融点のアガロースが固まるのを待って幼虫の位置を安定させます。
8. 注入圧力を200〜300 hPaの間で調整してください。注入時間を0.1〜0.3秒に設定すると、クロス トリジオイデス・ディフィシルの注入体積は3〜5 nLとなります。
9. 針をアガロースに優しく通し、次にゼブラフィッシュの幼虫の口の中、食道を通って挿入します。針の先端が前部腸球の中に入れたら、注射ペダルを押して細菌を排出します。投与された量で腸の腔を満たします。食道や総肛門から溢れ出さないようにしてください。ゼブラフィッシュの口から針を優しく引き抜きます。
10. ガバッジ後は、柔軟なマイクロローダーの先端でアガロースを切り取り、幼虫を持ち上げてアガロースから感染したゼブラフィッシュ幼虫を救出します。これらの幼虫を無菌30%ダニオー培地に移します。幼虫は滅菌培地で2回洗い流します。幼虫を新鮮な10cmのペトリ皿に移します。幼虫は受精後最大11日間維持されます(DPF)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロース	シグマ・オルドリッチ	A2576	超低ゲリングアガロース
アガロース低融点(LM)	プロナディサ	8050	アガロースプレートに使われます
毛細管ガラス	ハーバード・アパラタトゥス	30-0019	注射針
クロストリジオイデス・ディフィシル			R20291、リボタイプ027株、TcdA+/TcdB+/CDT+生産
DMSO	カール・ロス GmbH	A994
フィジー	オープンソースプラットフォーム		画像処理
ヘペス	カール・ロス GmbH	6763
水平ニードルプラー	サター・インストゥルメント社	P-87
L-システイン	シグマ・オルドリッチ	168149
ライカ アプリケーションスイートX(LAS X)	ライカ		画像処理
マイクロインジェクター	エッペンドルフ	5253000017
マイクロ射出成形	適応科学ツール	TU1
ライカSP8共焦点顕微鏡	ライカ
フェノールレッド	シグマ・オルドリッチ	P0290
塩化カリウム(KCl)	カール・ロス GmbH	5346
塩化ナトリウム(NaCl)	カール・ロス GmbH	9265
タウロコレート	カール・ロス GmbH	8149
トリカイン	シグマ・オルドリッチ	E10521
酵母抽出物	BDバクト	212750