真空浸透による シロイナズナの 葉への細菌病原体接種

要約

出典: ルフィアン, J. S., et.al.植物組織内の プソドモナスシリンガ 遺伝子の発現の単細胞解析。 J. Vis. Exp. (2022年)

この動画では、 シロイナズナ の葉に細菌病原体を導入する真空浸透法を実演しています。この方法は、準備された細菌懸濁液と真空パルスを用いて気孔を均一に通過させることで、葉の感染を制御します。

プロトコル

1. シロイナナズナの接種

注: 本研究では、 Pseudomonas syringae pv.の株を扱っています。トマトDC3000と P. syringae pv。フェーズオリコラ1448Aが使用されました。

1. P. syringaeの接種源を準備してください。
   1. 対象の P. syringae 株を−80°CのグリセロールストックからLBプレート(10 g/Lトリプトン、5 g/L NaCl、5 g/L 酵母抽出物、16 g/L 細菌用寒天)にストライクし、適切な抗生物質を補完します。28°Cで40〜48時間培養します。
      注: 対象株がプラスミドやゲノム耐性遺伝子を持っている場合は抗生物質の使用が推奨されます。 P. syringae の推奨抗生物質濃度は以下の通りです:カナマイシン(15 μg/mL)、ゲンタマイシン(10 μg/mL)、アンピシリン(300 μg/mL)。
   2. 細菌のバイオマスをこそげ取り、10 mM MgCl₂を5 mLに再懸浮させます。OD₆₀₀ を測定し、10 mM MgCl₂を加えて0.1に調整します。
      注:P. シリンガエ培養のOD₆₀₀ 0.1は5 x 10⁷ CFU·mL⁻¹に相当します。
   3. 連続希釈を10 mM MgCl₂ に行い、最終接種濃度5 x 10⁵ CFU·mL⁻¹に到達します。 シロイナズナ の植物用に200mLの接種剤を準備します。
   4. 接種直前に、 シロイヌズナの最終濃度0.01%に界面活性剤Silwett L-77を加えます。シルウェットは シロイヌナズプシス の組織にやや悪影響を及ぼすことに注意してください。
2. 真空浸透を行ってください。
   1. シロイナナズナの侵入には、鉢の上にX字型の木棒を2本置き(図1E)、鉢を下向きにして直径14cmのペトリ皿に置き、その皿には200 mLの接種物が入っています(図1F)。
   2. 接種液に浸した植物を真空チャンバーに挿入し(図1G)、500 mbarのパルスを30秒間葉に浸透させます。葉が完全に浸透するまで真空パルスを2〜3回繰り返します(図1H)。
   3. 余剰接種液を紙で排水し、植物を対応する成長室に戻します。

結果

図1: シロイナズナ植物を用いた細菌接種とアポフラスト抽出。(A) 金属網が適切に取り付けられた鍋の準備。(B)(C)に記載された通り、爪楊枝を使って種をまきまくこと。(D)シロイヌズプシスの植物が接種準備完了。(E) 2本の木製の棒で、鉢や土に届かずに細菌溶液に浸すのに役立ちま...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
140mmペトリ皿			特別な要件はありません
細菌寒天	ロコ
ゲンタマイシン硫酸塩	ドゥチェファ	G-0124
カナマイシンモノ硫酸塩	植物技術	K378
MgCl₂	メルク
NaCl	メルク
シルウェット L-77	クロムトン・ヨーロッパ株式会社
トリプトン	メルク
直径25cmの真空チャンバー	カーテル	554
真空ポンプ	ガス	DOA-P504-BN
酵母エキス	メルク
アンピシリンナトリウム	ゴールドバイオ