宿主上皮細胞における細胞内ブル セラ・アボルタス 感染のハイスループットイメージング

要約

出典: Casanova, A. ほか。ヘラ細胞の ブルセラ 感染に関与する宿主因子のハイスループットスクリーニングのための顕微鏡を用いたアッセイ。 J. Vis. Exp. (2016年)

本ビデオは、上皮細胞における ブルセラ・アボルタス 感染の高スループット画像化を、siRNA介在STINGノックダウンを用いて示し、細胞質DNA感知が細胞内細菌の複製および宿主の自然免疫応答に果たす役割を調査しています。

プロトコル

1. 感染と固定

1. 感染の前日に、250mlのスクリューキャップボトルに50mlのTSB/Km(50μg/mlカナマイシンを含むトリプティック大豆ブロス)培地で、決定量の B. abortus スターター培養を接種します。ボトルをパラフィルムで密封し、37°C、100rpmの軌道シェーカーで一晩、OD₆₀₀ = 0.8-1.1まで細菌を培養します。
2. 細菌培養液のOD₆₀₀ を測定し、感染培地をDMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)/10% FCS(胎児子牛血清)で希釈して、望ましい感染多重度(MOI)を達成します。
   注: HeLa細胞で5〜10%の感染率を得るために、MOIは10,000です。最適な感染率を得るために、各細胞タイプに対してMOI滴定曲線を測定する必要があります。
3. 自動プレートワッシャーを使って、384ウェルプレートのトランスフェクション培地を感染培地50μlと交換します。
4. 384ウェル板を400 x g、4°Cで20分間遠心分離します。
   注: これにより感染プロセスが同期されます。
5. プレートをパラフィルムで密封し、事前に温めたアルミプレートの上で、5%_CO2 を含んだ37°Cの湿度のあるインキュベーターで4時間培養します。
6. 細胞をDMEM/10% FCSに100μg/mlのGM(ゲンタミシン)を含む自動プレートワッシャー(200μl/ウェルオーバーフローウォッシュ使用)で細胞外細菌を不活化します。
   注: オーバーフロー洗浄中、自動プレートワッシャーは同時に媒質を噴出し、吸引します。
7. エントリーアッセイでは、自動プレートワッシャー(200 μl/ウェルオーバーフロー洗浄を使用)を用いて、DMEM/10% FCSで100 μg/ml Gmおよび100 ng/ml aTcを含む2回目の洗浄を行います。
8. プレートをパラフィルムで密封し、37°Cの湿度の高いインキュベーターで5%_CO2 を含んで事前に温めたアルミプレートに戻し、それぞれエンドポイントアッセイとエントリーアッセイで40時間または4時間保存します。
9. 固定には、PBS(リン酸塩緩衝生理食塩水)で自動プレートワッシャー(200μl/ウェルオーバーフローウォッシュ使用)でウェルを洗浄します。
10. PBSと50μl、3.7%パラホルムアルデヒド(PFA)を0.2 M HEPESで、pH7.4の自動プレートワッシャーを用いて交換します。
    注: 注意:PFAは吸入、皮膚への接触、飲み込みでも有毒です。
11. 室温で20分間培養します。
12. 固定培地を自動プレートワッシャーを使って50μlのPBSと交換します。
    注: サンプルは必要に応じてBSL3から取り出せる状態です。
    注意: BSL3(バイオセーフティレベル3)施設からのサンプルの採取は、リスク評価と手順の検証の対象となり、適用されるバイオセーフティの規制に依存します。

2. 染色

1. 細胞を50μlのPBSで2回洗浄します。
2. 細胞を50μl、0.1%トリトンX-100、PBSで10分間浸透させます。
3. 細胞をPBSで3回洗浄します。1 μg/mlのDAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニリンドール)を含むPBS20 μlを加え、室温で30分間培養します。
4. セルをPBSで3回洗い、アルミホイルで着色を光から守ります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリプティック大豆ブロス(TSB)	フルーカ	22092
カナマイシン硫酸塩	シグマ・オルドリッチ	60615
250mlのスクリューキャップボトル	コーニング	8396
DMEM	シグマ・オルドリッチ	D5796
胎児子牛血清(FCS)	ギブコ	10270	熱不活性化
Greiner CELLSTAR 384ウェルプレート	シグマ・オルドリッチ	M2062
剥がすアルミホイル	共演者	6570
試薬ディスペンサー:「マルチドロップ384試薬ディスペンサー」	サーモ・サイエンティフィック	5840150	代替試薬ディスペンサーの使用も可能です。
トランスフェクション試薬:「リポフェクタミンRNAiMAX	インビトロジェン	13778-150
自動プレートワッシャー:「プレートワッシャー ELx50-16」	バイオテック	ELX5016	このプレートワッシャーは384ウェルプレートに適した16チャンネルマニホールドを搭載しています。バイオセーフティキャビネットに収まり、洗浄時にプレートを覆う蓋が付いているため、エアロゾル発生のリスクを減らします。同様の機能を持つ代替プレートワッシャーも使用可能です。
ゲンタミシン	シグマ・オルドリッチ	G1397
PBS	ギブコ	20012
パラホルムアルデヒド	シグマ・オルドリッチ	P6148	0.2 M HEPESバッファー、pH 7.4に溶解します。-20°Cで保存し、使用前日に新鮮に解凍してください。注意:PFAは吸入、皮膚への接触、飲み込むと有毒です。
ヘペス	シグマ・オルドリッチ	H3375
トライトン X-100	シグマ・オルドリッチ	T9284
ダピ	ロッシュ	10236276001
Kif11 siRNA	ダルマコン	L-003317-00
ARPC3 siRNA	ダルマコン	L-005284-00
ブルセラ・アボルタス 2308
ヘラ CCL-2	ATCC	CCL-2
イメージエクスプレス マイクロ	分子デバイス	IXMイメージングMSCOPEです	精密モーター駆動のZ段を備えた自動セルラーイメージング顕微鏡。自動顕微鏡や、以下に指定するソフトウェア用の代替コンポーネントを利用できます。