誘導ラマン散乱顕微鏡を用いた細菌抗生物質感受性の検出

要約

出典: Zhang, M. ら、 単一細菌における重水素取り込みの刺激ラマン散乱イメージングによる迅速抗菌薬感受性試験。J. Vis. Exp. (2022年)

このビデオは、重水素標識代謝活動を追跡することで抗生物質に対する感受性を評価するために誘導ラマン散乱顕微鏡法の応用を示しています。炭素・重水素信号を監視することで、耐性菌や感受性細菌集団の迅速な検出を可能にします。

プロトコル

1. D₂抗生物質の存在下でのO組み込み治療 (図1a)

1. 600 nm波長の光度計で光学密度(OD)を測定して細菌濃度を測定します。
2. 重水素を含まない通常のミューラー・ヒントンブロス(MHB)培地で細菌溶液を希釈し、最終細胞濃度を8 x 10⁵ CFU/mLにします。優しく渦巻きて細菌細胞を混ぜます。
3. 細菌溶液を300μLのアリコートを7本の1.5 mLマイクロチューブに、600 μLの細菌溶液を1.5 mLのマイクロチューブに準備します。
4. 抗菌薬(ゲンタミシンまたはアモキシシリン)ストック溶液4.8 μL(1 mg/mL)を600 μLの細菌溶液を含むマイクロチューブに加え、最終抗生物質濃度を8 μg/mLにします。
5. 抗生物質含有細菌溶液8μg/mLから300μLの溶液を取り出し、さらに300μLの細菌溶液に加えることで、2倍に薄めた抗生物質(4μg/mL)細菌溶液を作ります。
6. テスト用抗生物質、ゲンタミシン、またはアモキシシリンを2回連続希釈し、最も低い濃度(0.25 μg/mL)のマイクロチューブに到達し、チューブから300 μLを廃棄します。ゲンタミシンとアモキシシリンの両方のシリアル濃度は0.25 μg/mLから8 μg/mLの範囲です。
   1. 抗生物質を使わないチューブを1本残して、ブランクコントロールをします。これは抗生物質治療なしで_D2O処理を用いて細菌の代謝活動を検査する陽性対照群となります。
   2. 抗生物質も_D2Oも使わないチューブを1本残して陰性コントロールを用いてください。
7. 細菌アリコートを特定の抗生物質(ゲンタミシンまたはアモキシシリン)を含むMHB培地で1時間培養します。
8. 培養中は、1.6段階で調製した抗生物質と同じ濃度勾配で100% D₂O含有培地を連続希釈して抗生物質を準備します。ゲンタミシンとアモキシシリンの両方のシリアル濃度は0.25 μg/mLから8 μg/mLの範囲です。
9. 抗生物質処理1時間後、同じ抗生物質濃度(ステップ1.6で調製)で、連続希釈抗生物質700μLと100% D₂O含有MHB培地をそれぞれ300μLの抗生物質前処理菌に加えます。
   1. 例えば、抗生物質前処理細菌300μLの8 μg/mLに100% D₂O含有のMHB培地700 μLを加えます。同様に、次の濃度の対応するチューブに移し、ピペットで上下に数回均質化します。
   2. 抗生物質フリーの100% D₂O含有MHB培地700 μLを、抗生物質を含まない細菌300 μL(ステップ1.6.1で調製)を加えてブランクコントロールします。
   3. 37°Cで200rpmのインキュベーションシェーカーでさらに30分間培養します。
      注: この段階では、試験用の培地中の最終濃度_D2Oは70%となります。
10. まず、抗生物質1mLとO処理済みの_D2Oを6200 x g で4°Cで5分間遠心分離し、その後精製水で2回洗浄します。最後に、サンプルを10%ホルマリン溶液に固定し、4°Cで保存します。

2. 単一細菌におけるD₂O代謝取り込みの刺激ラマン散乱(SRS)イメージング

1. 固定細菌溶液1mLを精製水で洗浄し、6200 x g で4°Cで5分間遠心分離機にします。上清液を除去します。細菌溶液を約20μLまで濃縮します。
2. 細菌溶液をポリL-リジンコーティングされたカバーガラスに浸透させます。サンプルをサンドイッチして密封し、SRSイメージングを行います。
3. SRS顕微鏡を用いてC-D振動周波数2168 cm-1の細菌を画像化します。
   1. コンピューターの制御ソフトウェアを使ってポンプの波長を852nmに入力・調整します。
   2. パワーメーターを使ってレーザー出力を測定します。試料のポンプレーザーの出力を~8 mW、ストークスレーザーの出力を~40 mWに設定します。レーザー出力の前方の半波長板を調整します。
      注: SRS顕微鏡では、80MHzの繰り返し周波数を持つ調整可能なフェムト秒レーザーが、ポンプ(680〜1300nm)およびストークス(1045nm)励起レーザーを提供します。
4. 反射鏡のネジを調整し、ポンプビームとストークスビームを空間的に整列させ、2Dガルボミラーシステムを備えた直立顕微鏡にレーザースキャンを誘導します。
   1. 60倍の水浸物レンズを使ってポンプとストークスレーザーをサンプルに集中させます。
   2. オイルコンデンサーを使って、試料からの前方方向の信号を収集します。
   3. ストークスレーザーをフォトダイオードに導く前に、バンドパスフィルターを使ってストークスレーザーをフィルターしてください。
   4. ロックイン増幅器で刺激されたラマン信号を抽出し、フォトダイオードで信号を検出します。
5. 各SRS画像はソフトウェアのコントロールパネルで200×200ピクセルとピクセル滞留時間を30μsに設定します。1枚の画像の総取得時間は~1.2秒です。 ステップサイズ を150 nmに設定し、画像サイズは約30 x 30 μm²になります。各サンプルに対して少なくとも3つの視野角をイメージしてください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
音響光学変調	グーチ&ハウスゴ	R15180-1.06-LTD	ストークスレーザービームの変調
アモキシシリン	シグマ・オルドリッチ	A8523-5G
バンドパスフィルタ	クロマ	HQ825/150m	フォトダイオードの前にストークスのレーザービームを遮断してください
塩化カルシウム	シグマ・オルドリッチ	C1016-100G	陽イオン調整
陽イオン調整ミューラー・ヒントンブロス	フィッシャー・サイエンティフィック	B12322	スープ希釈法による微生物の抗菌感受性試験
遠心分離機	サーモ・サイエンティフィック	75002542
カバーグラス	VWR	16004-318
スナップキャップ付き培養チューブ	フィッシャーブランド	149569B
重水素酸化物		151882	抗生物質を溶解するための有機溶媒
重水素酸化物-d6	シグマ・オルドリッチ	156914	SRSイメージングシステムの校正標準としての有機溶媒
大腸菌BW 25113	大腸遺伝ストックセンター	7636
エッペンドルフ・ポリプロピレンマイクロ遠心分離機チューブ 1.5 mL	フィッシャーブランド	05-408-129
ゲンタミシン硫酸塩	シグマ・オルドリッチ	G4918
親水性ポリビニリデンフッ化物フィルター	ミリポール・シグマ	SLSV025NB	孔径5μm
InSight DeepSee フェムト秒パルスレーザー	スペクトル物理学	モデル:インサイトX3	SRSイメージングのための調整可能なレーザー光源および1045 nmの固定レーザー光源
ロックインアンプ	チューリッヒ楽器	HF2LI	SRS信号の復調
油凝縮器	オリンポス	U-AAC	NA 1.4
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085(PAO1)	アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション	ATCC 47085
フォトダイオード	浜松	S3994-01	検出器
ポリプロピレン円錐管 15 mL	ファルコン	14-959-53A
ポリプロピレンフィルター	サーモ・サイエンティフィック	726-2520	孔径 0.2 μm
無菌ペトリ皿	コーニング	07-202-031
注射器 10 mL	フィッシャーブランド	14955459
UV/Vis分光光度計	ベックマン・カウルター	モデル:DU 530	600 nm波長での光学密度測定
ボルテックスミキサー	VWR	97043-562
水の目的	オリンポス	ウプラナポ/IR	60×、NA 1.2