病原体感染ショ ウジョウバエ 血球の高解像度共焦点イメージング

要約

出典: 広康A. 他。ショ ウジョウバエメラノガスター 幼虫から血液細胞を抽出し、微生物感染と分析を行う。 J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオは、Coxiella burnetiiに感染したショウジョウバエのメラノガスター血球を高解像度共焦点イメージングし、病原体の局在を3次元で可視化し、細胞内感染動態や宿主-病原体相互作用の詳細な解析を可能にします。

プロトコル

1. 共焦点イメージング
   1. 共焦点顕微鏡をDAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニリンドール)、EGFP(強化緑色蛍光タンパク質)、mCherryの三色イメージング用に設定します。以下の設定を使用します:DAPI励起(例)405 nm、放出(em)415-480 nm;EGFPは488 nm、EMは493-564 nm;mCherryは587nm、EMは597〜700nmです。
   2. サンプルを顕微鏡に置き、63X/1.4の数値絞り(NA)対物レンズを使って試料にピントを合わせます。画像撮影のために視野内に望ましい血球を位置づけます。
   3. レーザー出力と検出器の利得を調整し、試料の適切な露出を実現します。複数のZ面を確認し、試料厚全体に適した露出レベルを確認してください。
   4. 全血球のz軸上の上下の位置を見つけます。これらの位置をZセクションの開始位置と終了位置として設定します。
   5. スキャニングズームで血球を含む部分のみを画像化してください。ズーム係数は3倍でよく使われます。
   6. 画像系列を適切な解像度で収集します。例えばx-y平面は1024×1024ピクセル、z次元は0.3μmの間隔です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コキシエラ・ベルネティイ - mCherry	ハインツェン医師
顕微鏡カバーガラス	フィッシャー・サイエンティフィック	12-545-80
4'6-ジアミジノ-2-フェニリンドール	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	62247
共焦点微小小球	ライカ	TCS SP8-X 白色光共焦点レーザー走査顕微鏡
顕微鏡スライド	フィッシャー・サイエンティフィック	12-552-3