植物抽出病原体からの遺伝子発現の単細胞解析

要約

出典: Rufián, J. S., 他 植物組織内のプソドモナスシリンガ遺伝子の発現の単細胞解析。 J. Vis. Exp. (2022年)。

このビデオは、蛍光標識転写因子を用いて、植物抽出病原性細菌の単一細胞レベルで遺伝子発現を解析する方法を示しています。共焦点イメージングは病原性遺伝子発現の異質性を明らかにし、クローン細菌集団内の機能的多様性を浮き彫りにします。

プロトコル

1. アポプラスト抽出細菌の単細胞解析

1. 蒸留水に1.5%アガロース溶液を準備します。溶かしたら、並べて置いた2枚の顕微鏡スライドの間のスペースを満たすほどの容量を加え、その上にもう一枚スライドを置きます(図1)。15分間乾かし、上に置いたスライドを慎重に取り除きます。使用直前に刃物を使ってアガロースパッドを5mm×5mmの塊に切ります。
2. 同時に、アポプラスト抽出細菌1 mLを室温で12,000 x g で1分間遠心分離し、ピペットで上清液を慎重に除去し、ペレットを20 μLの水に再懸浮させて細胞を濃縮します。濃縮セルの2μL滴を0.17mmのカバースリップに置き、その滴を1段階で取得した5mm×5mmのアガロースパッドで覆います( 図1参照)。
3. 共焦点顕微鏡下で細菌の調製過程を可視化します( 材料表参照)。緑色蛍光細菌を識別するには、488 nmの励起レーザーと500 nmから550 nmの発光フィルターを使用します。すべての細菌を特定するには、明るい場を使い、両方の場を統合します。
4. 共焦点画像はフィジーを用いて処理してください(材料 表を参照)。これを行うには、MicrobeJプラグインを使って細菌細胞の輪郭を特定し、内部の蛍光強度を測定します。
   注: この分析には、単離細菌(クラスタリングされていない)からの画像取得が推奨されます。

結果

図1:寒天パッドの設定と調製の図式図。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.17 mm カバースリップ			特別な要件はありません
1.6 x 1.6 mm の金属メッシュ	不子府		ガラス繊維スクリーンメッシュ
50 mL円錐形チューブ	サーステット
アガロース	メルク
コンフォーカル顕微鏡 Stellaris	ライカ・マイクロシステムズ
フィジーソフトウェア