細菌の癒着と内部化を評価するためのin vitro腸モデル

要約

出典:カラタユド・アロヨ、M.ら。In vitro 腸内宿主-微生物界面における合成細菌コンソーシアムの存続可能性の評価。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、細菌の生存可能性を研究するためのin vitro腸内宿主-微生物モデルを実演します。Caco-2細胞とHT29-MTX細胞の共培養を、模擬消化条件下で事前処理された細菌と共培養します。上皮バリアの完全性は経上皮電気抵抗を用いて評価され、培地からの一部分、可溶性粘液、細胞溶解液、細胞残骸を収集して後流解析を行います。

プロトコル

1. 株と培養条件

注:合成口腔群集は口腔マイクロバイオームに一般的に存在する株で構成されていました。

1. アメリカタイプ培養コレクション(ATCC)から以下の株を取得してください:Aggregatibacter actinomycetemcomitans(ATCC 43718)、Fusobacterium nucleatum(ATCC 10953)、Porphyromonas gingivalis(ATCC 33277)、Prevotella intermedia(ATCC 25611)、Streptococcus mutans(ATCC 25175)、Streptococcus sobrinus(ATCC 33478)、アクチノマイセス・ナエスルンディ(ATCC 51655)、 ストレプトコッカス・ゴルドニー(ATCC 49818)、アクチノマイセス・ビスコスス(ATCC 15987)、およびストレプトコッカス・ミティス(ATCC 49456)です。
2. ライプニッツ研究所のDSMZ-ドイツ微生物・細胞培養コレクション(DSM 2007)からVeillonella parvulaを、BCCM/LMG細菌コレクション(LMG 14657)から血性連鎖菌を入手し、STREPTOCOCCUS salivuriusのTOVE-R株および口口ストレプトコッカスを使用します。

2. 口腔マイクロバイオームを代表する多種群集の開発

注:口腔内細菌がin vitro 腸上皮に付着する可能性をシミュレートするために合成群集を生成してください。血液寒天プレート上で細菌を培養し、5μg/mLのヘミン、1μg/mLのメナジオン、5%の滅菌除細動馬血液を補足します。簡単に言うと:

1. ヘミン100mgを1M水酸化ナトリウム(NaOH)2mLに溶かし、蒸留オートクレーブ水100mlを加えます。暗い容器で保管してください。培地に加える前に0.22μmのフィルターで滅菌してください。
2. 100mgのメナジオンを96%エタノール20mLに溶かします。培地に加える前に0.22μmのフィルターで滅菌してください。
3. 製造者の指示に従い、1リットルの血液寒天培地( 材料表参照)とオートクレーブを準備します。馬の血とサプリメントを加える前に冷ます。皿を混ぜて注ぎます。
4. 改良された脳心臓注入(BHI)スープを準備します。オートクレーブ後、ヘミン5μg/mLとメナジオン1μg/mLを加えます。
5. Hungateチューブに9mLの培地を投与し、ゴム栓とアルミニウムキャップで閉じます。チューブを窒素/二酸化炭素または_N2/_CO2 (90%/10%)で洗浄してください。
6. 嫌気性培地1mLを注射器で採取し、1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに入れます。各細菌種の単一コロニーを採取し、培地に再懸濁させて嫌気性修飾BHIに戻します。S. salivariusを除く37°Cで48時間培養します。S . salivariusは24時間培養が必要です。
7. 必要に応じて、合成コミュニティを組み立てる前に培養物の純度を確認してください。簡単に言うと:
   1. 液体培養からDNAを抽出し、プライマー27F(AGAGTTTGATYMTGGCTCAG)および1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACT)を用いて16S rRNA遺伝子を増幅し、以下のプログラムを行います:95°Cで5分間、95°Cで30サイクル1分、55°Cで1分、72°Cで1.5分、最後に72°Cで5分間延長します。
   2. メーカーの指示に従い、市販キット( 材料表参照)でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)製品を精製してください。
   3. 精製生成物のシーケンス反応を、10μLの総体積で、0.5μLの染料(材料 表参照)、3.2pmolのM13fプライマー(CGCCAGGGTTCCCACGAC)、2.0μLの5倍シーケンスバッファー、20ngのテンプレートを含み、市販のシーケンスシステム(材料表参照)を用いて行います(材料 表参照)。
      注:この手術は商業的に行われました。
   4. すべての配列(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)に対してBLAST検索を行い、最も近い既知の分類群を特定し、RDP分類器オンラインツール(http://rdp.cme.msu.edu/)およびSINA Alignmentサービス(https://www.arb-silva.de/aligner/)を用いて元の株の配列と比較します。
8. インキュベーション終了時に、フローサイトメトリーとSYBRグリーン/プロピジウムヨウ化物染色法を用いて細胞数を測定します。培養液を10個⁵ 細胞^mL-1に希釈し、修正BHIを用います。
9. S . mitis を1 mLを嫌気性BHI 75 mLに加え、定常期(6時間)まで培養します。その後、各希釈株を0.75mL採取し、嫌気性条件下で混合します。
10. すべての培養液が混ざったら、ミクロコスモス1mLを取り、75mLのBHIに加えます。合成群集を10%_CO2、10%水素(_H2)、80%Nで、37°C、200rpmで48時間培養します(材料 表参照)。
11. 2.8のように細胞密度を測定します。コミュニティをセルモデルに提示する前に。コミュニティの構成は定量的リアルタイムPCRで評価できます。さらに、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシングを用いて、初期メンバーの情報を提供します。いずれの同一確認プロトコルでも、cDNAをテンプレートとして用いて細菌がタンパク質を積極的に転写していることを示し、DNAをテンプレートとして株の有無を明らかにします。

3. 一般的な細胞培養の実践

注:ヨーロッパ認証細胞培養コレクション(Caco-2 ECACC 86010202およびHT29-MTX-E12 ECACC 12040401、Public Health England、英国)から使用された細胞株を取得してください。特に指定がない限り、細胞培養用の試薬は購入可能です(材料 表を参照)。

1. Caco-2およびHT29-MTX細胞株の維持および継承注:Caco-2およびHT29-MTX細胞は、補給されたドゥルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)を含む25^cm2 の組織培養フラスコで通常培養されています(表1)。細胞は60〜70%の合流に達するとトリプシン化されます。
   1. フラスコから細胞培養培地を取り出します。カルシウム/マグネシウムなしのPBS5mL(Ca⁺⁺/Mg⁺⁺)で2回洗います。
   2. 0.5 mg/Lのトリプシン溶液2 mLと0.22 g/Lのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を加えます。フラスコを優しく動かしてトリプシン溶液を分散させます。トリプシン溶液1.5mLを抽出し、フラスコを37°Cで10分間培養します。
   3. 顕微鏡でフラスコの表面から細胞が剥がれていないか確認してください。必要に応じてさらに5分間孵育してください。
   4. トリプシンを不活化するために、5mLの補足された細胞培養培地をフラスコに加えます。ピペットを上下に動かして均一な単細胞懸濁液を得る。
   5. すぐに細胞懸濁液50μLのアリコートを取り、カコ2細胞の場合は1:1(v/v)比率で滅菌0.4%トリパンブルー溶液、HT29-MTXの場合は1:5 v/vの割合で混めます。ピペッティングで混合し、計数室に詰めます( 材料表参照)。
   6. 顕微鏡で生存可能な細胞(白色明るい細胞)を数えます(製造元の説明書を参照)。
   7. 新しいフラスコに種子を、Caco-2とHT29-MTXの4×10 ⁵セル/cm²の密度で4 x 10 4 cells/cm²の密度で植えました。
      注:(1) カコ2細胞は分化し、合流に達するとタイトジャンクションを形成します。トリプシン化前に過剰な結合を避けることが非常に重要です。フラスコ内の細胞の過剰増殖は、トリプシン化や細胞凝集後の細胞剥離の失敗を引き起こすことがあります。(2) HT29-MTX細胞は高い代謝活性を持つ粘液を産生する細胞です。これらの特徴は、特に細胞密度が高い場合、細胞培養培地の急速な酸性化を引き起こす可能性があります。4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジネエスルホン酸(HEPES)バッファーを細胞培養培地に加え、pHを7から7.2の間に保つことができます(表1)。pHが下がると、コンフルーシティが50%未満のときに媒質を交換できます。しかし、コンフルエンシーが50%>場合は細胞培養を分割する必要があります。

4. 腸内宿主と微生物の界面をシミュレートするマルチコンパートメント細胞モデルの組み立て

注:共培養は直径24mm、孔径0.4μmの二重チャンバーウェルで完成します。材料 表参照。

1. 頂端区画に1.5mLの完全培養培地を、基底区画に2mLを加えます。シード時に細胞懸濁液の均一分布を得るために20〜30分間のプレインキュベートを行います。
2. セクション3で説明したように、Caco-2およびHT29-MTXの細胞培養をトリプシン化します。トリプシン化手順は、両細胞株を均一に分布させ、単一の細胞懸濁液で塊がつかまず均一に分布させるために正確に従う必要があります。
3. 3.1.8で説明された生存細胞を数えます。
4. 細胞密度を6.5×10、⁴ 細胞/cm^² に調整し、Caco-2/HT29-MTX細胞の割合を90/10にします。
5. 細胞懸存液を均質化し、対応するCaco-2およびHT29-MTX細胞を、補充された細胞培養培地とともに充填された滅菌容器に加えます。吸引によって、チャンバーの頂端側からプレインキュベートされた培地を取り除きます。
6. ピペッティングで細胞懸濁液を優しく混ぜ、1.5mLをチャンバーインサートの頂端区画に移します。シーディングの過程では、細胞が沈殿する傾向があるため、細胞懸濁液を常に均質化する必要があります。使用者の経験や作業速度に応じて、セル懸濁液は1〜3本の井戸を分散した後に混合する必要があります。
7. プレートを前後に優しく動かし、右から左、右へ(5〜10回)動かして、ウェル内のセルの均等な分布を得ます。インキュベーターに移し、プレートの動きを繰り返します。
8. Caco-2/HT29-MTX細胞の共培養を15日間維持し、2日ごとにDMEM補足で頂端および基底区画を更新します。この期間を経て、細胞培養培地は抗生物質や抗菌剤溶液なしで補給DMEMに交換できます。
9. 播種後20〜21日までは培地を2日ごとに更新してシステムを維持してください。
10. アッセイ開始前に、製造元の指示に従い、電気抵抗システム(材料表参照)を用いて上皮バリアの完全性を測定してください。
    1. 測定開始前に経上皮電気抵抗(TEER)装置が満充電(>24時間)であることを確認しましょう。
    2. TEER機器を電源から外し、プラスチック製のオートクレーブバッグでカバーを装着してください。バッグに穴を開けて電極を導入し、メーターの入力ポートに差し込みます。TEER機器をフローキャビネットに導入する前に、70%エタノール/水(v/v)をスプレーしてください。
    3. 電極を消毒するには、電極の先端を70%エタノール/水(v/v)の溶液に15分間浸します。15秒ほど自然乾燥させます。電極を予温化された細胞培養培地で洗い流します。
    4. 細胞をインキュベーターから取り出し、フローキャビネット内で細胞を室温にします。
    5. メーターが充電器から外されていることを確認してください。モードスイッチをオームに設定し、電源スイッチをオンにしてください。
    6. セル抵抗を測定するには、短い先端をインサートに浸し、長い先端を井戸から出して浸します。電極は板インサートに対して90度の角度で保ちます。

5. in vitro消化管輸送条件後の細菌生存

注意:すべての希釈物は超純水で準備してください。すべての溶液を0.22μmフィルターで滅菌し、無菌条件下で消化処理を行います。

1. 経口消化:
   1. 細菌群集3 mLを50 mLの滅菌チューブに入れ、3 mLの模擬唾液液(SSF)と混合します。SSFは(mmol ^L-1単位で)塩化カリウム(KCl)15.1;リン酸二水素カリウム(KH₂PO₄)、3.7;重炭酸ナトリウム(NaHCO₃)、6.8;塩化マグネシウム六水和物[MgCl₂(H₂O)₆]、0.5、炭酸アンモニウム[(NH₄) CO₃]、0.06;塩酸(HCl)1.1;塩化カルシウム二水和物[CaCl₂(H₂O)₂]、0.75。人間の唾液IX-A型から75 U/mLのαアミラーゼと、豚の胃II型から2 g/Lの粘液をSSFに加えます。
   2. 混合物を37°C、100rpmで2分間孵化させます。DNA抽出およびフローサイトメトリー定量(S1)のために2mLのサンプルを採取します。
2. 胃消化:
   1. 模擬胃液(SGF)4mLを追加し、(mmol L-1)を含む:KCl6.9;KH₂PO₄、0.9;NaHCO₃、25;塩化ナトリウム(NaCl)47.2;MgCl₂(H₂O)₆、0.1;(NH₄)CO3、0.5;塩酸15.6;CaCl₂(H₂O)₂、0.075。さらに、SGFには豚胃II型から2g/Lの粘液が含まれていました。
   2. pHを測定し、必要に応じて1 M HClでpH3に調整してください。37°C、100rpmで孵化します。2mLのサンプル(S2)を採取します。
3. 小腸の消化:
   1. 4mLの模擬腸液(SIF)を追加し、(mmol L-1)を含む:KCl、6.8;KH₂PO₄、0.8;NaHCO₃, 85;NaClは38.4;MgCl₂(H₂O)₆、0.33;塩酸8.4;CaCl₂(H₂O)₂、0.3、消化管への投与。
   2. 必要に応じてpH7に1 M NaOHを付けて調整してください。37°C、100rpmで孵化します。2 mLのサンプル(S3)を採取します。

6. in vitro消化管輸送条件下での細菌定着能力

1. 小腸消化液2 mLを2,650 x gで10分間遠心分離します。
2. 上澄液を取り除き、抗菌薬や抗菌剤を含まない5mLの補足DMEMと細菌ペレットを混ぜます。
3. フローサイトメーター(材料 表参照)を用いて、無傷または損傷した細胞を染色・定量します。
4. 抗生物質と抗菌薬を使わずに補充されたDMEMで希釈することで、細胞密度を10⁵ 個の生存細胞/mLに調整します。
5. トランスウェル系の頂端培地を取り除き、細菌懸濁液を1.5mL追加します。一般的な細胞培養条件下(37°C、湿度95%、_CO25%)で2時間共培養します。
   注:この時間は、必要な実験プロトコルによって最大48時間まで延長可能です。共培養は、通常の細胞維持に使われるインキュベーターとは異なるインキュベーターで維持できるため、汚染を防ぐことができます。
6. 4.11で説明されているように、インキュベーション後のTEER値を測定し、上皮バリアの完全性を評価します。
7. 潜伏期間終了後、頂端培地を除去し、さらに分析のために0.5mLを採取します(S4)。培地のサブサンプルは、製造元の指示に従い、乳酸脱水素酵素(LDH)アッセイによる細胞生存能力の評価に使用できます(材料 表参照)。
8. HBSS(NACバッファー)に10 mM N-アセチルシステインを0.5mL添加し、HT29-MTXによって生成される粘液を溶解し、付着した細菌を回収します。プレートを37°Cで1時間、攪拌(135 rpm、 材料表参照)でキュベーションします。
9. NAC-HBSSをマイクロ遠心分離機チューブ(S5)で回収し、細胞を1 mL DPBSで2回洗浄します。
10. 単分子層の上に0.5%トリトンX-100(w/v)0.5mLを加え、ピペッティングで細胞を破壊し、液体を回収して1分間渦を巻きます。洗剤で細菌細胞を傷つけないために、速さが非常に重要です。
11. 細胞を2,650 x gで5分間遠心分離し、上澄液(S6)とペレット(S7)を分離します。

7. サンプル解析

注:消化管消化を模擬した後、採取したサンプル(S1-S7)を解析し、細菌の生存可能性および腸細胞への付着可能性を評価します。

1. 細菌の生存率:サンプルS1-S5を0.45μmフィルターに2回通し、ステップ2.8で示された生死細胞染色およびフローサイトメトリーを用いて細菌細胞を定量します。
2. 接着電位:S1-S6に対して連続希釈(-1から-8)を準備し、血液寒天および修飾BHIプレートに10μLのストリークを施します。嫌気性条件下で37°Cで24〜48時間培養します。同じ量の希釈されていないS7をメッキします。
   1. 付着細菌の分類学的同定:
      1. 培養ループで個々のコロニーを選び、それぞれ10μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。この懸濁液4μLを採取し、2.7.1で記述されたプライマーと条件を用いて16S rRNA遺伝子のPCR増幅のテンプレートとして使用します。
      2. 2.7.3のプロトコルに従ってシーケンスを行い、2.7.4に含まれる手順でシーケンスの検証を行います。
3. 必要に応じて、全DNA抽出、qPCR定量、16S rRNAアンプリコンシーケンス、RNA抽出、トランスクリプトミックプロファイリングなどの下流解析も行います。
   注:フローサイトメトリーの定量はサンプリング直後に実施されました。膜透過性細胞の対照として、70°Cに3分間曝露したサンプルを使用しました。背景ノイズは、細菌を含まない細胞培養モデルから得られた消化液またはサンプルをフローサイトメトリーで測定することで評価されました。すべてのサンプルは三重に測定されました。

 

表1:細胞培養維持のための細胞株および培地組成の記述。

細胞培養	アヒューマー/サスペンション	培養培地	一般的な補遺	特定のサプリメント	倍時間	抱卵条件
Caco-2(ECACC 86010202)	支持者	4.5 g/L グルコースの Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)	不活化胎児用牛血清(10% v/v) ペニシリン(100 U/mL)* ストレプトマイシン (0.1 mg/mL)* アンホテリシン (0.0025 mg/mL)*	グルタマックス(4 mM) 非必須アミノ酸(1% v/v) ピルビン酸(1 mM)	65–72	湿度95%、CO2 10%のCO2 インキュベーター( 材料表参照)
HT29-MTX(ECACC 12040401)	支持者			HEPES(1 mM)	20–24 h
* 抗生物質および抗真菌薬はアッセイ開始の2日前に細胞培養培地から除去されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ストライング
Aggregatibacter actinomycetemcomitans	アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション	ATCC 43718
フソバクテリウム・ヌクレアタム	アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション	ATCC 10953
ポルフィロモナス・ギンギバル	アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション	ATCC 33277
Prevotella intermedia	アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション	ATCC 25611
ストレプトコッカス・ミュータン	アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション	ATCC 25175
ストレプトコッカス・ソブリヌス	アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション	ATCC 33478
アクチノマイセス・ビスコスス	アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション	ATCC 15987
ストレプトコッカス・サリバリウス TOVE-R
連鎖球菌ミティス	アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション	ATCC 49456
血性連鎖球菌	BCCM/LMGバクテリアコレクション	LMG 14657
ヴェイヨネラ・パルヴラ	ライプニッツ研究所 DSMZ-ドイツ微生物・細胞培養コレクション	DSM 2007
ストレプトコッカス・ゴルドニー	アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション	ATCC 49818
細胞株
カコ-2細胞	ヨーロッパ認証細胞培養コレクション	86010202
HT29-MTX細胞	ヨーロッパ認証細胞培養コレクション	12040401
試薬と消耗品
ブレインハートインフュージョン(BHI)ブロス	オキソイド	CM1135
ブラッドアガー2	オキソイド	CM0055	ブラッドアガー培地
メナディオン	シグマ	M9429
ヘミン	シグマ	H9039
5%の無菌除細血管馬の血液	E&Oラボラトリーズ社、	P030
InnuPREP PCRpure キット	アナリティク・イェナ	845-KS-5010250	PCR精製キット
ビッグ・ダイ	応用バイオシステム	4337454	シーケンス用の染料
ABI Prism BigDye Terminator v3.1 サイクルシーケンスキット	応用バイオシステム	4337456
SYBR グリーンI	インビトロジェン	S7585
プロピジウムヨウ化物	インビトロジェン	P1304MP
T25培養フラスコはコーティングされず、細胞培養処理済みで、換気され、無菌されています	VWR	734-2311
トリプシン-EDTA溶液	シグマ・オルドリッチ	T3924-100ML
トライパンブルー溶液0.4%、液体、滅菌ろ過済み	シグマ・オルドリッチ	T8154
リン酸塩緩衝塩水(PBS)	ギブコ	14190250
グルタMAXおよびピルビン酸を用いたDMEM細胞培養培地	生命技術	31966-047
コーニング・トランスウェルポリエステル膜細胞培養インサート	シグマ・オルドリッチ	CLS3450-24EA
豚胃タイプIIからの粘液	シグマ・オルドリッチ	M2378
不活化胎児用牛血清	グライナー・バイオ・ワン	758093
抗生物質・抗菌薬(100倍)	ギブコ	15240062
分子生物学のためのトリトンX 100	シグマ・オルドリッチ	T8787
カルシウム、マグネシウムなしのDPBS	ギブコ	14190-250
Pierce LDH細胞毒性検査キット	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	88953
Corning HTS Transwell-24 well、孔径 0.4 μm	コーニング・コスター社	3450
ヌクレアーゼフリー水	セルヴァ電気泳動	28539010
装備
ノイバウアー計数室の改良	カール・ロス	T729.1
BD Accuri C6フローサイトメーター	BDバイオサイエンス	653118
PowerLyzer 24 ホモジナイザー	モビオ	13155
T100サーマルサイクラー	バイオラッド	186-1096
フラッシュシステム	特注品	-
InnOva 4080 インキュベーターシェーカー	ニューブランズウィック・サイエンティフィック	8261-30-1007	シェイカー for 2.10
メマートCO₂インキュベーター	メマート有限会社	ICO150med
ミリセルERS(電気抵抗システム)	EMDミリポア、メルクKGaA	MERS00002
ミリポール・ミリ-Q学術用超純水システム	ミリポーア、メルク KGaA	-
シェイカー(ROCKER 3Dベーシック)	イカ	4000000	6.10のシェイカー