細菌感染検出のための葉から総DNA抽出

要約

出典: Chen, H., 他 柑橘類の葉組織サンプルを用いた従来のPCRを用いた柑橘類緑化病原体 Candidatus liberibacter 属の特異的かつ正確な検出。 J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオは、病原性細菌に感染した柑橘類の葉組織から全ゲノムDNAを抽出する方法を示しています。このプロトコルは、師部制限病原体の下流PCR検出のための信頼性の高いDNA回収を可能にします。

プロトコル

1. ゲノム抽出キットを用いて植物組織からゲノムDNAを分離する

1. 柑橘類の葉組織は、きれいなハサミで新鮮な柑橘の木から丸ごと切り取り、きれいなプラスチックのサンドイッチ袋に入れます。
   注: 葉片を入った袋は、収集後すぐに4°Cの冷蔵庫に入れるか、断熱容器に入れて氷の上に保管し、腐敗を防ぐようにしてください。
2. 乳鉢と乳棒を冷やすために少量の液体窒素を加えます。冷やしている間に、ハサミで約1平方インチの小さな葉片を切り取ります。切ったティッシュをモルタルに入れて即座に凍らせます。必要に応じて液体窒素を追加してください。
   注: 液体窒素を扱う際は、断熱手袋を必ず着用してください。
3. モルタルで植物の組織を素早く細かく粉状にすりつぶします。液体窒素が完全に蒸発し、細かい緑色の粉末が残るまで粉砕を続けます。
4. 金属ヘラを液体窒素で10〜15秒ほど短く冷やし、その後、臼の中の粉末組織をヘラを使って1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブにすくい入れます。
5. 1000μLピペットを用いて600μLの核溶解溶液( 材料表参照)を加えます。サンプルを1〜3秒ほどボルテックスし、その後65°Cの水浴で15分間培養します。
6. 10μLのピペットを使って3μLのRNase溶液を溶解液に加え、チューブを2〜5回反転させて混合し、キャビネットインキュベーターで37°Cで15分間インキュベートします。
   注: 混合物を室温まで冷ましてから作業を進めてください。
7. タンパク質沈殿液200μLを加え、高速で20秒ほど渦を巻き、その後13,000 x gで3分間遠心分離して固いペレットを作ります。サンプルを遠心分離している間、室温のイソプロパノール600 μLを新しい1.5 mLのマイクロ遠心分離管に加えます。
8. 1000μLピペットを用いて、遠心分離サンプルから上澄液を慎重に取り出し、イソプロパノールを含む新鮮な1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。ペレットはこれで廃棄できます。
   注: ペレットの上にごくわずかな上清液を残して、上清液をタンパク質で汚染しないようにしましょう。
9. チューブを逆さまにしてDNAが糸状の塊として見えるようにし、室温で13,000 x gの遠心分離機で1分間かけます。
10. 上清液をデカントし、70%エタノール600μLを加え、チューブを数回反転させてDNAを洗浄し、13,000 x gで1分間遠心分離します。
11. エタノールを慎重に吸引し、緩いDNAペレットを残し、チューブを開けて逆さにして吸収性の紙の上に置きます。室温で15分間自然乾燥させます。
12. 乾燥したDNAペレットに100μLのDNA再水和溶液を加え、65°Cの水浴で1時間培養し、チューブをタップして定期的に混合します。
13. 1μLの精製水をマイクロキューベットに入れ、分光光度計に挿入してブランクとして使用します。マイクロキュベットに1μLのサンプルを置き、分光光度計に挿入してDNA濃度を計算します。DNA濃度(ng/μL)は希薄因子×50 ng/μL× (A₂₆₀ -_{A 320})として計算できます。
    注: ここでプロトコルを一時停止できます。試料は4°Cで保存可能です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウィザード ゲノミックDNA精製キット	プロメガ	A1120	核溶解、RNase、タンパク質沈殿、DNA再水和溶液の供給源
液体窒素	エアプロダクツ	該当なし
5424卓上遠心分離機	エッペンドルフ	05-403-93
Isotemp 215デジタル水浴	フィッシャー・サイエンティフィック	15-462-15Q
金属スパチュラ	シグマ・オルドリッチ	Z283274
乳鉢と乳棒	シグマ・オルドリッチ	Z247464
LSEボルテックスミキサー	コーニング	6775
2-プロパノール	シグマ・オルドリッチ	I9516
滅菌10μLチップ	TipOne	1161-3730
滅菌200μLチップ	TipOne	1163-1730
滅菌1250μLチップ	TipOne	1161-1750
可変容量ピペットキット	VWR	75788-460
トリスベース	シグマ・オルドリッチ	10708976001
1.5 mLマイクロ遠心分離機チューブ	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	3439