リン酸カルシウム法によるトランスフェクションを用いたシュードウイルスのパッケージング 完全DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培地を用いて、HEK293FT細胞の単一細胞懸濁液（9 x 10^5 cells/mL）を作成する（表1）。単一細胞懸濁液10 mLをT75フラスコに加え、トランスフェクション前に37 °C、5%二酸化炭素（CO2）インキュベーターで20時間培養する。 注：低継代数（20代未満）のHEK293FT細胞を推奨する。細胞単層が80～90%コンフルエントであることを確認すること。 トランスフェクションの2時間前に、培地をクロロキン（100 µM）含有の新鮮な完全培地10 mLに交換する。 表2および図1に示すように、以下の試薬およびプラスミドDNAを混合する：ddH2O（二回蒸留水）、pCMV/R-HA、pCMV/R-NA、pHR-Luc、pCMV Δ8.9、2.5 M CaCl2（塩化カルシウム）、および2x 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）緩衝液。ピペッティングで5回静かに混ぜ合わせ、室温（RT）で20分間静置する。 混合液を細胞上の培地へと移し、フラスコを静かに揺らす。細胞インキュベーターで15時間培養する。 培地を新鮮な完全DMEM培地15 mLに交換する。37 °C、5% CO2インキュベーターで65時間培養する。 注：培地の色は淡いオレンジ色またはわずかに黄色になり、倒立光顕微鏡下で少なくとも80%の細胞に細胞変性効果（CPE）が認められるはずである。 上清を回収し、4 °Cで2095 x gにて20分間遠心分離する。上清を回収して分注し、-80 °Cで保存する。 表1：完全DMEM培地の組成 完全DMEM培地の組成 | 濃度 --- | --- Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | 1x 胎児牛血清 | 10% ペニシリン(1 U/mL)/ストレプトマイシン | 1 μg/mL 表2：シュードウイルスパッケージングシステム 材料 | 濃度 | 液量 --- | --- | --- 2x HEPES (pH 7.1) | -- | 675.0 μL CaCl2 (2.5 M) | -- | 67.5 μL ddH2O | -- | 529.2 μL pCMV Δ 8.9 | 1000 ng/μL | 18.9 μL pCMV/R-HA | 100 ng/μL | 27.0 μL pCMV/R-NA | 50 ng/μL | 13.5 μL pHR-Luc | 1000 ng/μL | 18.9 μL Chang, X., 他リン酸カルシウム・トランスフェクション法による擬似型H5鳥インフルエンザウイルスの調製および抗体中和活性の測定 J. Vis. Exp. (2021)
このビデオでは、リン酸カルシウム媒介プラスミド導入法を用いてヒト細胞内でインフルエンザ擬似ウイルスを作製する方法を解説します。これにより、バイオセーフティレベル2の条件下で、抗体中和試験などの後続アプリケーションに使用するためのシングルサイクルウイルス粒子を安全に生成することが可能になります。
