ジャガイモにおけるジャガイモウイルスXを用いたmicroRNAサイレンシング

要約

出典：Zhao, J., et al. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato. J. Vis. Exp. (2020).

このビデオでは、ウイルスベースのmicroRNAサイレンシング（VbMS）のために、Agrobacterium tumefaciensを用いてジャガイモウイルスX（PVX）ベースの構築物をin vitroで育成したジャガイモ植物に導入する方法を実演します。この手法により、標的microRNAの全身的な抑制が可能となり、観察可能な表現型変化を通じて、植物の成長におけるその役割を研究することができます。

プロトコル

1. ジャガイモ植物でPVXベースのVbMSアッセイを行う。

1. in vitroで育成した4週齢のジャガイモ植物体を土壌に移植する。移植後3〜4日目に、これらの植物体を用いてVbMSアッセイを行う。
2. ジャガイモ植物に以下を接種する： アグロバクテリウム PVX-STTM（Short Tandem Target Mimic）プラスミドを含む
   注意： ジャガイモにおけるVbMSアッセイでは、 アグロバクテリウム-を介した浸潤法と爪楊枝による擦過接種を同時に行う。
   1. PVX-STTMベクターを含むポジティブ形質転換体を選別し、以下の成分を含む50 mLの液体LB培地に接種する。 50 μg/mL カナマイシンおよび 50 μg/mL リファンピシン。28 °Cのインキュベーターで220 rpmで16時間、OD600 = 1.0になるまで培養する。 28 °C 220 rpmのインキュベーターで、ODが1.0になるまで16時間培養する。₆₀₀ = 1.0.
   2. 同時に、陽性の アグロバクテリウム コロニーを、50 μg/mLカナマイシンおよび50 μg/mLリファンピシンを含む少なくとも2枚の新しいLBプレートにストリークし、 50 μg/mL カナマイシンおよび 50 μg/mL リファンピシンを含む培地で、～にて培養する 28 °C 1日間培養する。コントロールとしてPVX-LICベクターを、またウイルスの拡散をモニタリングするためにPVX-GFPを含める。
   3. ～を回収する アグロバクテリウム 遠心分離（3,400 x g）による液体培養物の回収 g 室温で10分間。再懸濁 アグロバクテリウム 等量の浸潤バッファー（10 mM MgCl2₂、10 mM MES、および 200 µM アセトシリンゴン、pH = 5.6）とし、OD₆₀₀ = 1.0に調整する。室温で6時間インキュベートする。
   4. アグロバクテリウム培養液を注入します。 アグロバクテリウム 1 mLの針なしシリンジを用いて、十分に展開した葉の裏面（背面）にアグロバクテリア培養液を浸潤させる。
      1. 片手で葉を裏返しに保持し、もう一方の手の指一本で、浸潤部位の葉身を向軸側（表側）から支えます。もう一方の手でシリンジを葉の表面に対して垂直に保持し、浸潤させます。 アグロバクテリウム 葉身の背面へ培養液を浸潤させる。
   5. LBプレートからAgrobacterium培養液を掻き取り、 アグロバクテリウム LBプレートからアグロバクテリウム培養液を採取し、接種したジャガイモ植物の最初か2番目の節間の茎表面を爪楊枝で擦る。茎の表皮を優しく擦るようにし、植物に深刻な損傷を与える可能性があるため、茎を貫通させないように注意すること。
3. 接種した植物を、以下の条件下で育成する。 22 °C 16時間明期／8時間暗期の光周期および以下の光強度で 120 μmol/m²∙ s¹ 温室内で。
   注： miRNAサイレンシングによって誘発される表現型は、通常、接種後2～4週間で現れます（図1, 図2通常、浸潤後10〜20日でVbMS表現型が現れます。VbMS表現型は、特定のmiRNAおよび標的遺伝子の特性、育成条件、およびジャガイモの品種によって異なります。

結果

図1：4倍体ジャガイモ品種KatahdinにおけるmiR165/166のVbMS。PVXベクターコントロールまたはPVX-STTM165/166を発現させたジャガイモ植物（Katahdin）の表現型。マゼンタ色の矢印は、葉脈に異所的に形成された葉構造を示す。オレンジ色の矢印頭は、ラッパ状の葉構造を示す。スケールバー = 1 cm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Agrobacterium tumefaciens 株：GV3101、GV2260 または EHA105
肥料：Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed	ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA	G99260
MgCl₂	ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA	MFCD00149781
PVX VIGS ベクター：PVX-LIC
土壌：Metro-Mix 360	Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA	Metro-Mix 360
			Zhao et al., 2016