アデノ随伴ウイルスに対する網膜透過性を評価するためのマウス網膜凍結切片の作製

要約

動物サンプルを用いるすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査および承認されています。網膜の凍結切片（図1）については、摘出した眼球を解剖して水晶体と角膜を除去し、4%パラホルムアルデヒドで1時間浸漬固定します。あらかじめ固定した眼球を、10%ショ糖溶液で室温にて1時間、次いで20%ショ糖溶液で室温にてさらに1時間、凍結保護します。その後、30%ショ糖溶液中で4 °Cにて一晩凍結保護します。眼杯をCryo-matrixなどの埋込樹脂で凍結埋め込みします。10 µmの凍結切片を作成し、染色時の組織密着性を向上させるために、凍結組織切片用に特別処理されたスライドガラスにマウントします。pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に0.1% Triton X-10を加えた溶液で5分間、切片を透過処理します。PBSで2回洗浄し、1%牛血清アルブミン（BSA）および0.1% Tween 20を含むPBSを用いて、室温で1時間ブロッキングします。 Vacca, O., 他 アデノ随伴ウイルスを用いた疾患における網膜バリアの研究ツールとしての活用 J. Vis. Exp. (2015)

このビデオでは、破壊された網膜バリアを介したアデノ随伴ウイルス（AAV）の透過性を視覚化するための、マウス網膜凍結切片の作製手順をステップバイステップで解説します。

プロトコル

動物サンプルを用いるすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会の審査および承認を受けています。 

1. 網膜の凍結切片（Figure 1）を作成するため、摘出した眼球を解剖して水晶体と角膜を除去し、4% パラホルムアルデヒドに1時間浸漬固定する。
   1. 固定済みの眼球を、10% ショ糖溶液で室温にて1時間、続いて20% ショ糖溶液で室温にてさらに1時間、凍結保護処理する。その後、30% ショ糖溶液中で4 °Cにて一晩凍結保護を行う。眼球カップをCryo-matrixなどの包埋剤で凍結包埋する。10 µmの凍結切片を作成し、染色時の組織付着性を向上させるために凍結組織切片用に特殊処理されたスライドガラスにマウントする。
   2. pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に含まれる0.1% Triton X-10で5分間処理し、切片を透過性にする。PBSで2回洗浄し、1% 牛血清アルブミン（BSA）および0.1% Tween 20を含むPBS中で室温にて1時間ブロッキングを行う。

結果

図1：全般的なプロトコルの概略図。アデノ随伴ウイルス（AAV）の作製後、麻酔をかけた成マウスの硝子体または陰茎静脈に粒子を注入する。Micron IIIカメラを用いて眼底画像を撮影し、緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現を追跡する。GFPの発現パターンは、免疫組織化学および共焦点画像を用いて、網膜の凍結切片およびフラットマウント網膜で解析する。硝子体内または腹腔内に注入したマウスから採取した血液サンプルのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）解析により、血流中へのAAV粒子の存在を示すGFP配列を検出することで、血網膜関門（BRB）のAAV通過を評価する。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Cryomatrix embedding resin	Thermo Scientific	676906
Superfrost plus adhesion slides	Thermo Scientific	1014352
Binocular magnifier SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	Zoom 0.6 x 5 x LED、スタンド付き透過・落射照明 / 網膜の解剖
Spring scissors straight - 8.5 cm	Bionic France S.a.r.l	1503-08	網膜の解剖