網膜膜整合性の低下を可視化するためのAAV媒介性遺伝子導入

要約

動物サンプルを用いるすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会のレビューおよび承認を受けている。 1. 免疫組織化学染色 網膜フラットマウント（図1）については、摘出した眼球を4%パラホルムアルデヒドで15分間固定し、解剖を容易にする。15～30分後、眼球を解剖して角膜と水晶体を除去する。鋸状縁（ora serrata）と視神経の周囲を切断し、網膜を網膜色素上皮（RPE）および強膜から分離させる。さらに4%パラホルムアルデヒドに30分間浸し、網膜および導入された網膜細胞内の蛍光タンパク質を固定する（固定時間は24時間を超えてはならない）。滅菌PBS（pH 7.4）で5分間洗浄する。 リン酸緩衝生理食塩水（PBS）をブロッキング緩衝液（1%牛血清アルブミン（BSA）、2%正常ヤギまたはロバ血清、0.5% Triton X-100含有PBS）に置換し、室温で4時間、または4 °Cで一晩ブロッキング緩衝液中でインキュベートする。組織を一次抗体を含むブロッキング緩衝液とともに、室温で4時間または4 °Cで一晩インキュベートする。PBSで3回洗浄する。 注：使用する抗体は以下の通りである：内境界膜（ILM）を標識する抗ラミニン抗体（1/1,000）、桿体細胞を標識する抗ロドプシン抗体クローン4D2（1/500）、ミュラー細胞を標識する抗グルタミン合成酵素抗体クローンGS-6（1/1,500）、錐体細胞を標識するピーナッツ凝集素（PNA）レクチン（1/40）。 遮光条件下、室温にて、1:500に希釈したAlexa Fluor標識二次抗体を含むブロッキング緩衝液中で、組織を1時間（凍結切片）または2時間（フラットマウント）インキュベートする。PBSで3回洗浄する。 網膜に弛緩切開を加え、光受容体側または網膜神経節細胞（RGC）側を上にしてガラススライドにフラットマウントする。水溶性封入剤を加え、カバーガラスを被せ、4 °Cで保存する。 共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて共焦点顕微鏡観察を行う。励起光と蛍光のクロストークを低減するため、画像を一行ずつ順次取得する。ナイキスト＝シャノンのサンプリング定理に従ってステップサイズを決定する。最終画像において飽和画素を最小限に抑える露光設定を使用する。12ビット画像をFIJIで処理し、Z-project機能を用いて最大強度投影（Maximum Intensity Projection）によりZセクションを単一平面に投影し、最後に8ビットRGBカラーモードに変換する。 Vacca, O., 他疾患における網膜バリアの研究ツールとしての腺随伴ウイルスの活用 J. Vis. Exp. (2015).

このビデオでは、トランスジェニックマウスの網膜へのAAV介在性遺伝子導入、それに続く組織切除および染色を行い、内境界膜の完全性を評価する方法を説明します。

プロトコル

動物サンプルを用いるすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会の審査および承認を受けています。

1. 免疫組織化学染色

1. 網膜フラットマウント（Figure 1）を作成する場合、解剖を容易にするため、摘出した眼球を4%パラホルムアルデヒドで15分間固定する。
   1. 15～30分後、眼球を解剖して角膜と水晶体を除去する。鋸状縁（ora serrata）と視神経の周囲を切断し、網膜を網膜色素上皮（RPE）および強膜から分離させる。さらに4%パラホルムアルデヒドに30分間浸漬し、網膜および形質導入された網膜細胞内の蛍光タンパク質を固定する（固定時間は24時間以内にすること）。滅菌PBS（pH 7.4）で5分間洗浄する。
   2. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）をブロッキングバッファー（1%牛血清アルブミン（BSA）、2%正常ヤギまたはロバ血清、0.5% Triton X-100を含むPBS）に交換し、室温で4時間または4 °Cで一晩ブロッキングバッファー中でインキュベートする。
2. 組織を一次抗体を含むブロッキングバッファーに入れ、室温で4時間または4 °Cで一晩インキュベートする。PBSで3回洗浄する。
   注：使用する抗体は以下の通りである。ILM（内境界膜）を標識するanti-laminin (1/1,000)、桿体を標識するanti-rhodopsin clone 4D2 (1/500)、ミュラー細胞を標識するanti-glutamine synthetase clone GS-6 (1/1,500)、錐体を標識するPeanut agglutinin (PNA) Lectin (1/40)。
3. 組織を、ブロッキングバッファーで1:500に希釈したAlexa Fluor結合二次抗体とともに、室温・遮光条件下で1時間（凍結切片）または2時間（フラットマウント）インキュベートする。PBSで3回洗浄する。
4. 網膜に緩和切開を加え、光受容器側または網膜神経節細胞（RGC）側を上にしてガラススライド上にフラットマウントする。水溶性封入剤を加え、カバーガラスをかけて4 °Cで保存する。
5. 共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて共焦点顕微鏡観察を行う。励起光と蛍光のクロストークを低減するため、画像を1行ずつ逐次的に取得する。ナイキスト＝シャノン標本化定理に従ってステップサイズを決定する。最終画像で飽和画素が最小限になるように露光設定を行う。FIJIを用いて12-bit画像を処理し、Z-project機能の最大強度投影（maximum intensity projection）を用いてZセクションを単一平面に投影し、最後に8-bit RGBカラーモードに変換する。

結果

図1：一般プロトコルの概略図。AAV作製後、麻酔をかけた成マウスの硝子体または陰茎静脈に粒子を注入する。Micron IIIカメラを用いて眼底画像を撮影し、GFP（緑色蛍光タンパク質）の発現を追跡する。GFPの発現パターンは、免疫組織化学染色および共焦点画像を用いて、網膜の凍結切片およびフラットマウント網膜で解析する。BRB（血中網膜関門）を通過したAAVは、硝子体内または陰茎内に注入したマウスから採取した血液サンプルのPCR解析により、血流中におけるAAV粒子の存在を示す指標であるGFP配列の有無を確認することで評価する。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Superfrost Plus Adhesion Slides	Thermo Scientific	10143352	スライドグラス
Anti-laminin	Sigma	L9393	抗体
Anti-rhodopsin clone 4D2	Millipore	MABN15	抗体
Anti-glutamine synthetase clone GS-6	Millipore	MAB302	抗体
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein	Dako	334	抗体
PNA Lectin	Invitrogen	L32459	プローブ
Alexa fluor conjugated secondary antibodies	Invitrogen		抗体
Fluorsave reagent	Calbiochem	345789	封入剤
Evans Blue dye	Sigma	E2129	染料
Formamide spectrophotometric	Sigma	295876-2L
Fluorescein	Sigma	F2456	染料
Micron III	Phoenix Research Labs		3-CCDカラーカメラ、フレームグラバー、市販ソフトウェアに基づいた顕微鏡システムにより、マウス網膜のイメージングが可能。
Binocular magnifier SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	ズーム 0.66 x 5 x LED、スタンド付き、落射・透過照明 / 網膜解剖用
Spring scissors straight - 8.5 cm	Bionic France S.a.r.l	15003-08	網膜解剖用