レポータータンパク質をコードする組換えHBV（B型肝炎ウイルス）の作製 HepG2細胞の調製 細胞培養培地（10%胎児ウシ血清 (FBS)、10 U/mlペニシリン、10 µg/mlストレプトマイシン、および10 U/ml非必須アミノ酸を添加したDulbecco改良イーグル培地 (DMEM)）を調製する。 トランスフェクションの前日に、4 x 10⁶個のHepG2（ヒト肝細胞癌G2）細胞を、10 mlの培養培地とともに10 cmコラーゲンコートディッシュに播種する。HepG2細胞を、加湿5% CO₂インキュベーター内、37 °Cで培養する。 注：10 cmコラーゲンコートディッシュに4 x 10⁶個のHepG2細胞を10 mlの培養培地で播種すると、翌日にはコンフルエンシーが70-90%になる。 トランスフェクション 製造者の指示に従い、トランスフェクション試薬を用いて、5 µgのpUC1.2HBV delta epsilon15（epsilon配列に欠損のあるHBV複製プラスミド）および5 µgのpUC1.2HBV/NL15をHepG2細胞にトランスフェクションする。 翌日、培養培地を除去し、10 mlの新鮮な培養培地を添加する。 トランスフェクションの1週間後、組換えHBVを含む培養培地を50 mlチューブに移し、ステップ1.3へ進む。トランスフェクションした細胞を含むプレートに、10 mlの新鮮な培養培地を添加する。 注：組換えHBVの産生は4週間維持される。組換えHBVを含む培養培地は4 °Cで1ヶ月間保存可能である。 組換えHBVの精製 遠心分離（2,30 x gで5分間）により、組換えHBVを含む培養培地から細胞残渣を除去する。 上清を0.45 µmメンブレンフィルターでろ過する。 組換えHBVを含む培養培地に、等量の26% PEG/1.5 M NaCl（ポリエチレングリコール60：130 g、NaCl（塩化ナトリウム）：49 g、0.5 M EDTA（エチレンジアミン四酢酸） pH 8.0を1 ml、1 M HEPES（N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸） pH 7.6を5 ml含み、全量を50 mlとしたもの）を加え、穏やかに混合する。4 °Cで一晩インキュベートする。 4 °Cで2,30 x g、20分間遠心分離する。 上清を捨て、ペレットを0.5 mlのTNE（10 mM Tris、50 mM NaCl、1 mM EDTA）で溶解する。 2,30 x gで5分間遠心分離し、残渣を除去する。 組換えHBVを含む0.5 mlのTNEを、TNEで調製した0.8 mlの20%スクロース層の上に積層する。 15 °Cで10,00 × g、3時間遠心分離する。 上清を可能な限り除き、ペレットを回収する。開始時の培養培地40 mlあたり1 mlの無血清DMEMで再懸濁する。 4 °Cで一晩インキュベートする。 0.45 µmフィルターでろ過する。0.5 mlずつ分注し、-80 °Cで保存する。 注：元のウイルスサンプルにレポータータンパク質の混入が認められる場合は、TNE中の5-30%スクロースを用いた密度勾配超遠心分離（10,0 x gで2時間）、またはCsCl（塩化セシウム）密度平衡遠心分離（1.1-1.6 g/ml、150,0 x gで50時間）によりウイルスを精製する。 西辻 H.、 他、et al. 複製サイクルの初期段階をモニタリングするためのB型肝炎ウイルスレポーターシステムの構築 J. Vis. Exp. (2017)
このビデオでは、組換えB型肝炎ウイルス粒子の作製および精製方法を解説します。これにより、初期の感染過程の研究やハイスループットな抗ウイルス薬スクリーニングへの応用に適した、安全で複製能を欠くウイルス調製物の作成が可能になります。
