蚊への導入 deionized water（脱イオン水）を用いて、1齢のAedes albopictus幼虫10匹を3回洗浄し、その後、95 mLのdeionized waterを含むビーカーに幼虫を移す。組換えAedes aegypti densoviru (rAaeDV) ストックを5 mL添加する（最終濃度 1.00 x 10^10 copies/mL）。 28 °Cで24時間インキュベートし、deionized waterを用いて幼虫を3回洗浄した後、幼虫をプレートに戻し、通常通り給餌する。 qPCRまたはウェスタンブロットを用いて、幼虫における標的遺伝子の発現レベルをモニターする。 注：蛍光信号検出法を用いることで、感染した幼虫をより正確に分離できる。例えば、DsRedを発現する組換えウイルスに感染した幼虫の蛍光信号を検出する場合、幼虫を凹面スライドガラス上に置き、感染後2日まで8時間ごとに倒立蛍光顕微鏡下で観察する。蛍光を発する幼虫が検出されたら、以降の継続的な観察を可能にするため、個別のプラスチック製試験カップに分離する。この方法により、複数の組織に感染した幼虫を特定できる。 Liu, P., 他蚊の幼虫における遺伝子の機能解析のための遺伝子導入ベクターとしての組換え蚊デンソウイルスの利用。 J. Vis. Exp. (2017)
このビデオでは、マイクロRNAをコードする組換え蚊デンソウイルスを用いて、蚊の幼虫における特定の遺伝子をサイレンシングする方法を解説します。感染した初期齢幼虫は、機能的なマイクロRNAを産生し、下流の解析に向けた標的遺伝子の発現抑制を可能にします。
