TEM試料調製 TEM用のカーボン支持膜（ニッケル）グリッドを用意する。 注：施設内の顕微鏡で使用する推奨試薬およびその取り扱いについては、コアファシリティに相談すること。水分への曝露を最小限にするため、グリッドは乾燥剤を入れたボックスまたは真空チャンバーに保管すること。 フィルターペーパーを約5 cm x 5 cmの大きさに切り出す。ガラス製ペトリ皿と、顕微鏡操作に適したセルフクロージングのリバースピンセットを用意する。 パラフィンフィルムを約2.5 cm x 5 cmに切り出し、ベンチトップに置く。 ノロウイルスGII.4 Sydneyカプシドの熱処理 カプシドとして組み上がった精製ヒトノロウイルス主要カプシドタンパク質（VP1）GII.4 Sydney（アクセッション番号：JX45908）を用意する。注：本研究におけるカプシドは、R. Atmar（ベイラー医科大学、テキサス州ヒューストン）より提供されたものである。 キャップ付きの個別のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）チューブ内で、カプシドを10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）（pH 7.4）を用いて最大15 µLの容量に希釈する。チューブに少なくとも60 ngのカプシドが含まれていることを確認する。処理条件とリガンドの組み合わせごとに60 ngのカプシドを用意すること。 サーマルサイクラーを目的の熱処理温度に予熱する。注：本プロトコルでは、68 °Cで異なる時間（0～25分）の処理を選択した。 即座に冷却できるよう、別のサーマルサイクラーを4 °Cに予熱しておく。カプシド溶液の入ったチューブをサーマルサイクラーに入れ、目的の時間まで加熱する。加熱後、直ちに4 °Cに予冷したサイクラーに移し、5分間保持する。 遠心分離機で短時間スピンダウンし、すべての液滴をチューブの底に集める。 処理済みカプシド溶液の約15 µLの液滴すべてを、パラフィンフィルム上にピペットで滴下する。 ピンセットでグリッドの端を掴み（ピンセットが端で閉じてグリッドを保持するようにする）、液滴の上にカーボン面を下にしてグリッドを置く。カプシドがグリッドに付着するように、10分間インキュベートする。 カプシド調製物の純度に応じて、必要であれば10 mM HEPES溶液による洗浄を行う。処理済みカプシドの液滴の後に、10～15 µLの液滴を直線上に配置して行う。 10分後、液滴ごとグリッドを拾い上げる。フィルターペーパーにグリッドをほぼ垂直に当てて、液滴を吸い取る。10～15 µLのHEPESバッファーの液滴をグリッドで拾い上げ、30秒間保持した後、別のフィルターペーパーで吸い取って洗浄する。 パラフィンフィルムの空いている領域に、2%酢酸ウラニル溶液を15 µL滴下する。 酢酸ウラニルの液滴をグリッドで拾い上げ、45秒間保持する。溶液の大部分が除去されるように、酢酸ウラニルを吸い取る。グリッドをカーボン面を上にしてフィルターペーパーの上に置く。この際、グリッドがピンセットの水分に「貼り付かない」ように注意すること。グリッドが載ったフィルターペーパーを、開いたガラス製ペトリ皿に入れる。 注：プラスチック製ペトリ皿は使用しないこと。静電気的にグリッドが引き寄せられ、皿に張り付くためである。 すべての処理条件について同様に繰り返す。TEMで観察する前に、グリッドが入ったペトリ皿をデシケーターに入れて一晩乾燥させる。 調製したグリッドの観察については、各機関の顕微鏡施設に相談すること。施設によっては、利用者が施設内の装置の操作トレーニングを受けることが許可されている。特定の顕微鏡のセットアップおよび観察に関する詳細は、本記事の範囲外である。 Moore, M. D., 他 ウイルスキャプシドの構造的完全性を決定するための代替的なインビトロ法 J. Vis. Exp.(2017).
このビデオでは、精製されたウイルスキャプシドを熱処理し、透過電子顕微鏡（TEM）を用いて試料調製および観察を行うことで、構造変化と熱による損傷を明らかにする方法を実演します。
