1.バクテリオファージφBB-1のPEG（ポリエチレングリコール）沈殿後の形質導入アッセイ
- トランスダクションアッセイの受容菌として使用するB. burgdorferi培養液を調製する。決定した密度に基づき、1 × 107 spirochetes·mL−1の濃度で15 mLとなる受容菌培養液の量を算出する。
- 算出された量の培養液を6,000 x gで10分間遠心分離する。上清をデカンテーションし、ペレットを14.5 mLの新鮮なBSK (Barbour-Stoenner-Kelly) 培地で再懸濁する。
- 受容クローンの培養液に、500 µL以下のPEG沈殿ファージサンプルを添加する。十分に混合し、33 °Cで72-96時間インキュベートする。
注意：PEG沈殿で回収されるファージ量は、多くの要因によって変動し得る。しかし、誘導したB. burgdorferi株CA-11.2Aの15 mL培養液からは、通常500 µLあたり50-1,000の生存ファージが含まれる。500 µL以上のファージ回収量を添加すると、BSKに対するSM (Suspension Medium) の比率が高まるためと考えられ、B. burgdorferiの増殖に悪影響を及ぼす。 - PEG沈殿ファージと混合した後、固相プレーティングによりトランスダクタントの選択を行う。
2. 形質導入体の選別
注意：潜在的な形質導入体の固相プレート塗布は、プロトコルのシングルレイヤー改変法を用いて行います。B. burgdorferiのコロニーは寒天内部で増殖するため、固相プレート塗布による形質導入体の選択では、プレートを注いでいる間にサンプルを培地に添加する必要があります。この手法も形質導入体の選択に有効である可能性がありますが、この目的での試行はまだ行われていません。
- 導入試験およびコントロールのサンプル数に基づき、導入細胞の選抜に必要なプレート数を決定する。
注： 通常、1サンプルにつき2枚のプレートを準備し、1枚には培養液量の約10%相当を、もう1枚には残りの培養液を分注します。さらに、選択に使用する抗生物質存在下で、ファージ調製液および／またはドナーおよびレシピエントとして使用した親クローンが個別に増殖しないことを確認するための、陰性コントロール用プレートも準備します。また、少なくとも2枚分以上の予備のプレート材料を用意しておくことが推奨されます。例えば、プレートに分注するサンプルとコントロールの合計数が8つの場合は、10枚分のプレート混合液を準備します。 - 以下に述べる手順に従って、プレート播種用の溶液を調製する。
注： 各プレートは30 mLとし、播種用の1.5x BSK 20 mLと2.1%アガロース 10 mLで構成します（比率 2:1）。これにより、最終濃度が1x BSKおよび0.7%アガロースのプレートとなります。例えば、10枚のプレートを作成する場合、1.5x BSK 200 mLと2.1%アガロース 100 mLからなる、計300 mLの播種用混合液を調製してください。- 1.5x BSKの各成分に記載された分量を用いて、1.5x BSKを1 L調製する。保存方法は1x BSKの記載に従う。
- 2.1%のアガロースを水で調製し、オートクレーブで滅菌する。アガロース溶液は調製後すぐに使用するか、室温で保存する。室温で保存した場合は、プレートに分注する前に、蓋を軽く閉めた状態で電子レンジで完全に融解させるまで加熱する。
- プレートミックス全体の量に基づき、適切な濃度にするために必要な抗生物質の量を決定します。
注意： 最終的なプレート塗布用溶液の全量が300 mLである場合、1.5x BSK 200 mLに、300 mL全体で適切な最終抗生物質濃度になる十分量の抗生物質を混ぜ合わせる。導入試験におけるドナーとレシピエントが異なる抗生物質耐性遺伝子を持つ場合は、プレート塗布用混合液に両方の抗生物質を含める必要がある。ドナー由来のPEG沈殿ファージが抗生物質耐性マーカーをコードしており、レシピエントが耐性を持たない場合は、プレート塗布用混合液には1種類の抗生物質のみを含める。
- 作製するプレートの枚数に基づき、1.5x BSKおよび抗生物質を、プレート用混合液全体を保持できる十分な大きさの滅菌ボトルに適切な量だけ移します。以下の温度の水槽で平衡化します。 56 °C 15分以上。
- オートクレーブまたは電子レンジで溶解させたアガロースを、以下の容器内で平衡化させます。 56 °C ウォーターバスで15分以上保温する。
- 平衡化後、決定した量の2.1%アガロースを1.5x BSK（抗生物質含有）が入ったボトルに加え、プレート用溶液を再びウォーターバスに戻し、 42 °C 10～15分間。
注意： 高温ではスピロヘータに損傷を与えたり、死滅させたりする可能性があります36。上記の工程と同じウォーターバスを使用する場合は、ウォーターバスを42℃まで冷却してください。45 °C 平衡化のタイマーを開始する前に。プレート塗布溶液を次の温度で平衡化させないでください。 42 °C 20分以上放置しないでください。そうしないと、プレートに分注している間に凝固し始めます。 - 平衡化の間、以下を準備します。 B. burgdorferi プレートに播種するサンプル。播種する量を滅菌済みの50 mLコニカル遠心チューブに移す。
- 1.5 mL未満の量をプレートに播種する場合（<（最終的なプレート分注量30 mLの5%に相当する量）、サンプルを新しいチューブに移し、プレートに播種する際にプレート用ミックスをサンプルに直接添加してください。
- より大きな容量の場合は、必要な量の培養液を新しいチューブに移し、室温で6,000 x g、10分間遠心分離します。100 $\mu$L以外の上清をすべて捨てます。500 µL 上清を回収し、残りの上清を用いて、プレーティング前にペレットを完全に再懸濁させる。
- 共培養後のコントロールプレート用として、ドナーまたはレシピエントクローンの細胞を10^7個以上、滅菌済みの50 mLコニカル遠心チューブに加える。液量が1.5 mLを超える場合は、遠心分離してペレットを再懸濁させる。PEG沈殿ファージを用いて導入試験を行った場合は、レシピエントクローンに加えて100-250 µL プレート作成のため、ファージ試料を滅菌済みの50 mLコニカルチューブに分注します。
- プレート用溶液が42℃で平衡状態に達した後、45 °C 10～15分後、プレート用溶液30 mLを適切なサンプルが入ったチューブに移し、直ちにプレート用混合液とサンプルをラベル付きプレートに分注します。プレートに播種するサンプルごとに、新しいピペットを使用してこの操作を繰り返します。
- プレートを15〜20分間静置して凝固させた後、次へ移動させてください。 33 °C 5% CO₂添加インキュベーター₂プレートを注いだ後、少なくとも48時間は倒立させないでください。
- レシピエントクローンの背景に応じて、選択プレート上のアガロース内に10〜21日間の培養後にコロニーが出現しているかを確認する。滅菌済みの綿栓付き5.75インチホウケイ酸ガラス製ピペットを用い、両方の抗生物質が存在するプレート上で生育したコロニーを少なくとも5〜10個ピックアップし、適切な抗生物質を添加した1x BSK 1.5 mLに接種する。
- 接種したコロニーを、以下の条件で培養します。 33 °C 3～5日間、または暗視野顕微鏡を用いて200倍で観察した際に、1視野あたり約20～40本のスピロヘータの密度に達するまで培養します。
注： スクリーニング後、これらのスピロヘータは−で長期保存するために凍結させることができます。80 °C 同量の培養液を、60%グリセロールとフィルター滅菌済みの40% 1x BSKの混合液と混合することにより 0.22 µm フィルター
