オルガノイドのレンチウイルス導入 0日目： 導入の2日前に、0.95 cm²のウェルいっぱいに存在するオルガノイドを新しいウェルに分割し、約50個の小さなオルガノイドを得るようにする。オルガノイドを分割する（図1A、B）。 オルガノイド培養液に10 µMのChir99021および10 mMのニコチンアミドを添加し、嚢胞性過増殖陰窩を得る（図1C）。 注：分割直後のオルガノイドをChir99021存在下で培養すると、嚢胞性陰窩が最もよく形成される。 2日目： p1000マイクロピペットを用いてMatrigelと培地をピぺッティングし、混合物を分散させてオルガノイドを回収する。混合物を15 mLチューブに入れる。 先端を加熱して細くしたパスツールピペットを用いて、さらに分散させる。オルガノイドを100 x gで5分間遠心分離してペレット化する。 注：遠心分離機のサイズに応じて、遠心速度を調整すること。分散させたオルガノイドが混合物から分離する正確な速度を確認する必要がある。 上清を除去し、あらかじめ温めておいた1xトリプシン（0.25%トリプシンに相当）500 µLを添加する。オルガノイドをトリプシンに懸濁し、37 °Cのウォーターバスで3分間インキュベートする。 細胞株培養液［10%胎児牛血清 (FCS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、およびグルタミンを添加したDulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)］3.5 mLを添加してトリプシンを不活化させる。500 x gで5分間遠心分離する。 上清を除去し、約20 µLの培地中にペレットを残す。この少量の培地とともにオルガノイドを48ウェルプレートのウェルに移す。 導入培地に含まれる高タイターのレンチウイルスを添加して懸濁し、ステップ3.10へ進む（導入効率が低い場合）。 注：効率的な導入のためには、通常、1ウェルのオルガノイドに対して250 µLの高タイターレンチウイルス1アリコートを添加する。これは、1回の作製で回収された全レンチウイルスの50%に相当する。 オプション：導入効率を高めるには、オルガノイドを含む48ウェルプレートを32 °Cに予熱した遠心機に入れ、600 x gで1時間回転させるスピノキュレーションを行う。 オルガノイドとウイルスの混合物を培養インキュベーターに入れ、37 °Cで1時間インキュベートして導入させる。 オプション：さらに導入効率を高めるには、培養インキュベーターにて37 °Cでさらに3時間インキュベートする。 1 mLのオルガノイド培養液を加え、オルガノイドとウイルスの混合物を再懸濁させ、マイクロ遠心チューブに移して850 x gで5分間遠心分離し、オルガノイドをペレット化する。 上清を除去し、ペレットを20 µLの氷冷Matrigelに懸濁する。素材は温度が上がると凝固するため、氷冷PBSを数回ピぺッティングして冷却したピペットチップを使用すること。 ドロップレットを48ウェルプレートのウェル中央に置き、37 °Cの培養インキュベーターで15分間インキュベートして凝固させる。 15分後、10 mMニコチンアミド、10 µM Chir99021、および10 µM Y27632を添加したオルガノイド培養液250 µLを慎重に加える。分散した小さなオルガノイド断片は、24時間以内に小さな嚢胞性オルガノイドを形成する。 5日目： 培地を更新し、選択用抗生物質（ピューロマイシンの場合は4 µg/mL）を添加する。 7日目： 培地を選択用抗生物質を添加した標準的なオルガノイド培養液に交換する。 注：Chir99021の除去から2〜3週間で出芽が完了する。選択後は、選択用抗生物質なしでオルガノイドを培養することができる。 Van Lidth de Jeude, J. F., 他 腸管オルガノイドのレンチウイルス導入およびダウンストリーム解析のプロトコル J. Vis. Exp. (2015)
このビデオでは、陰窩様構造を含む懸濁液からのマウス腸管オルガノイドへのレンチウイルス導入について説明します。基底膜マトリックスを足場として使用し、成長因子を添加した培地を用いることで、レンチウイルスベクターを導入し、安定的な遺伝子組み込みを可能にします。
