デュアルアデノウイルス導入を用いたSMADパスウェイ活性化の検出

要約

生細胞へのデュアルアデノウイルス導入 12ウェルプレートの各ウェルに、5%胎児牛血清（FBS）を含む50 μLのDulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培地を用いて、1.0～1.5 x 10^5個のMDA-MB-231細胞を播種する（細胞コンフルエンシー35%、計2ウェル）。10%の感染陽性率を達成するため、感染多重度（MOI）2,500となるよう、アデノウイルスベクターAd-CMV-GFP（タイター = 5 x 10^9 PFU/mL） 75 μLおよびアデノウイルスベクターAd-CAGA12-Td-Tom（タイター = 5 x 10^10 PFU/mL） 7.5 μLを細胞に感染させる。アデノウイルス感染直後、ウェルあたり0.25 μLのトランスフォーミング増殖因子-β（TGF-β）（ストック濃度 10 mg/mL、最終濃度 5 ng/μL）を添加する（または添加しない）。プレートを37 °C、10% CO2のインキュベーター内で24時間培養する。位相差蛍光顕微鏡を用いて生細胞をイメージングする。緑色蛍光タンパク質（GFP）を470 nmで、Td-Tomatoタンパク質を54 nmで励起させる。 Chen, H., 他TGF-βの生存細胞イメージングβアデノウイルスレポーターシステムを用いたin vitroおよびin vivoにおけるSmad3シグナル伝達経路の解析 J. Vis. Exp.. (2018).

このビデオでは、2種類のアデノウイルス感染を用いて乳がん細胞におけるSMAD経路の活性化を研究する方法を実演します。一方のウイルスは恒常的に発現するGFP遺伝子を導入し、もう一方はSMAD感受性プロモーターの下流にRFPレポーターを保持しています。TGF-beta刺激によりSMADタンパク質が活性化されると、複合体を形成してRFPの発現を誘導します。生細胞において2つのシグナルが検出されることで、経路の活性化が確認されます。

プロトコル

1. 生細胞単一細胞における二重アデノウイルス導入

1. 12ウェルプレートの各ウェルに、5%胎児牛血清（FBS）を含む50 μLのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いて、1.0 - 1.5 x 10⁵個のMDA-MB-231細胞を播種する（細胞コンフルエンシー35%、計2ウェル）。
2. アデノウイルスベクターAd-CMV-GFP（タイター = 5 x 10⁹ PFU/mL）75 μLとアデノウイルスベクターAd-CAGA12-Td-Tom（タイター = 5 x 10¹⁰ PFU/mL）7.5 μLを細胞に感染させ、感染多重度（MOI）を2,50とする。これにより、10%の感染陽性率を達成できる。
3. アデノウイルス感染後すぐに、ウェルあたり0.25 μLのトランスフォーミング増殖因子ベータ（TGF-β）（ストック濃度 10 mg/mL、最終濃度 5 ng/μL）を添加して処理するか、あるいは添加せずに保持する。
4. プレートを37 °C、10% CO₂のインキュベーター内で24時間培養する。
5. 位相差蛍光顕微鏡を用いて生細胞を撮像する。緑色蛍光タンパク質（GFP）を470 nmで、Td-Tomatoタンパク質を54 nmで励起させる。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	ThermoFisher	181024	使用前に37 °Cのウォーターバスで加温する
胎児ウシ血清	Scientifix Life	FBS50-S	使用前に熱不活化を行う
組換えヒトTGF-β1	PEPROTECH	100-21	DDWで分注し、最終濃度を10 mg/mLにする
位相差蛍光顕微鏡	OLYMPUS	IX50
MDA-MB-231	ATCC	CRM-HTB-26
溶液			組成
FBS-DMEM			5% 熱不活化FBS; 10 μg/mL ペニシリン; 10 μg/mL ストレプトマイシン