感染ヒトリンパ球におけるウイルス核酸およびタンパク質の多重蛍光イメージング

要約

1. タンパク質免疫染色：目的のタンパク質を標識するため PBS（リン酸緩衝生理食塩水）を捨て、20 µLのブロッキング緩衝液（0.1% v/v Tween-20を含むPBS（PBST）に1% w/v BSA（牛血清アルブミン）および10% v/v FBS（ウシ胎児血清）を加えたもの）をカバースリップに加える。室温で1時間インキュベートする。 ブロッキング緩衝液を捨て、PBST + 1% w/v BSAで希釈した一次抗体20 µLを適用する。室温で1時間インキュベートする。 スライドをPBSTで2回、室温で10分間、振盪しながら洗浄する。 任意の二次抗体をPBST + 1% w/v BSA中で室温で1時間適用する。 スライドをPBSTで室温で10分間、振盪しながら洗浄する。 2. 核染色：免疫染色後、核を対比染色する PBSTを捨て、DAPI（4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）または任意の核染色剤を室温で1分間適用する。 スライドをPBSで2回、室温で10分間、振盪しながら洗浄する。 Shah, R., 他ウイルス核酸およびタンパク質を可視化し、HIV、HTLV、HBV、HCV、ジカウイルス、およびインフルエンザ感染をモニタリングするための単一細胞マルチプレックス蛍光イメージング。 J. Vis. Exp. (2020)

このビデオでは、ブランチドDNAハイブリダイゼーションと免疫蛍光法を用いて、感染したヒトリンパ球におけるHIV-1 DNA、RNA、およびカプシドタンパク質を同時に可視化し、個々の細胞内におけるウイルス複製の段階を詳細に解析する方法を実演します。

プロトコル

1. タンパク質免疫染色：目的のタンパク質を標識する

1. PBS（リン酸緩衝生理食塩水）を除去し、20 µLのブロッキングバッファー（0.1% v/v Tween-20を含むPBS（PBST）に1% w/v BSA（牛血清アルブミン）および10% v/v FBS（ウシ胎児血清）を添加したもの）をカバーガラスに加える。室温（RT）で1時間インキュベートする。
2. ブロッキングバッファーを除去し、PBST + 1% w/v BSAで希釈した一次抗体20 µLを適用する。室温で1時間インキュベートする。
3. スライドをPBSTで室温にて10分間、振盪しながら2回洗浄する。
4. 適切な二次抗体を、PBST + 1% w/v BSA中で室温にて1時間適用する。
5. スライドをPBSTで室温にて10分間、振盪しながら洗浄する。

2. 核染色：免疫染色の後に核を対比染色する

1. PBSTを捨て、DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)または任意の核染色剤を滴下し、RTで1分間反応させる。
2. スライドをPBSで2回、RTで10分間、振盪しながら洗浄する。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Anti-HCV NS5a抗体	Abcam	ab1383	マウスモノクローナル抗体; HCVジェノタイプ1a、1b、3、および4に適用可能
Anti-HIV-1 p24モノクローナル抗体	NIH AIDS Reagent Program	3537
Anti-Mov10抗体	Abcam	ab80613	ウサギポリクローナル抗体
ウシ血清アルブミン			免疫染色のためのブロッキング剤
サプリメント添加済み細胞培地			細胞モデルに適した培地
カバーガラス
DAPI	ACD Bio		核染色剤（ACD Bio製RNAscopeキット）
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (1X PBS)	Gibco	14190250	カルシウムおよびマグネシウム不含
胎児ウシ血清 (FBS)			二次抗体の作製動物に基づいた特定のFBSを使用すること（例：ヤギFBS）
Fisherbrand colorfrost plus顕微鏡スライドグラス	Fisher Scientific	12-50-17/18/19	洗浄済み
スライドグラス
Tween-20			DNAハイブリダイゼーションバッファーおよびPBS-T用