1. インタソームの可溶化 1.1 清潔な表面で、新しいカミソリまたはメスを用いて200 µLチップの先端から2～4 mmを切り取り、ワイドボアピペットチップを2本準備する。注：これらのチップはステップ1.3および1.5で使用する。 1.2 透析チューブを透析バッファーから取り出す。クリップ付近のチューブ末端に残っている透析バッファーによってインタソームサンプルが希釈されるのを防ぐため、小型のピペットチップを装着したマイクロピペットを用いて、余分な透析バッファーを除去する。透析チューブの一端からクリップを取り外す。 1.3 ステップ1.1で準備したワイドボアピペットチップを使用して、透析チューブ内の沈殿物を含むサンプルを、氷上の1.5-mLチューブに移す。注：回収された物質の全量は通常約140 µLである。 1.4 沈殿物を含むサンプルは200 mM NaClである。適切な量の5 M NaClストック溶液を加え、最終濃度を320 mM NaClまで上げる。例えば、サンプルが150 µLの場合、5 M NaClを3.9 µL、ddH2Oを1.1 µL加え、最終容量を155 µLとする。サンプルを入れたアイスバケットを4 ℃の低温室に移す。 1.5 ステップ1.1で準備したワイドボアピペットチップを用いて、ピペッティングにより沈殿物を再懸濁し、可溶化させる。これを少なくとも1時間、20分ごとに繰り返す。ほとんどの沈殿物が溶解することを確認する。 注：時間経過に伴う沈殿物の減少が顕著に認められなくなった時点で、再懸濁のためのピペッティングを停止してもよい。ウイルスDNA（vDNA）が未標識または内部標識の場合、目視確認に基づくと沈殿物は約90%減少する。Cy5末端標識vDNAの場合、沈殿物は約20%しか減少せず、蛍光色素末端標識vDNAを含む沈殿物の大部分は可溶化しない。効果的に可溶化される沈殿物の量は変動するため、経験的に決定する必要がある。 2. インタソームの精製 2.1 サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）用ランニングバッファー（20 mM Bis-tris propane, pH 7.5, 320 mM NaCl, 10% glycerol）を250 mL準備する。バッファーを0.2-µmフィルターユニットで滅菌ろ過し、4 ℃で保存する。注：すべての精製ステップは4 ℃の低温室で行う。 2.2 架橋アガロースSECカラム（直径 = 10 mm、長さ = 300 mm、ベッドボリューム = 24 mL、サンプル量 = 25～500 µL、最大圧力 = 1.5 MPa、分画限界 = 4 x 10⁷ Da、分離分子量範囲 = 5～5,000 kDa、材料一覧表を参照）を、SECランニングバッファーを用いて流速0.4 mL/minで平衡化する。 注：300 kDaと44 kDaを効果的に分離できるSuperose 12 10/300 GLやSuperose 6 Increaseなどの異なるサイズ排除カラムに本精製法を適応させることができる。Superose 12 10/300 GLは分解能が低いため、ピークの重なりが多くなる。対照的に、Superose 6 Increaseは分解能が高く、より優れた分離が可能である。 2.3 インタソームサンプルをマイクロ遠心機を用いて4 ℃、14,000 x gで10分間遠心分離し、残存する沈殿物をペレット化する。上清を慎重に回収する。上清を200 µLインジェクションループ（約200 μLを保持できるチューブ）にロードする。サンプルをSECカラムに注入する。注：ロード量を少なくすることで、SECによる分解能を高めることができる。 2.4 25 mLのSECランニングバッファーで溶出し、270 µLずつ95分画を回収する。SECクロマトグラムに3つのA280/A260ピークが表示されることを確認する（図1）。注：最初のピークは凝集体（溶出量 約9.0～11.5 mL）、次いでPFVテトラマーインタソームピーク（溶出量 約12.0～14.75 mL）、そしてPFV INモノマーおよび遊離vDNAのピーク（溶出量 約15.0～18.0 mL）となるはずである。 Mackler, R. M., 他プロトタイプ・フォーミー・ウイルスのインタソームの調製および精製 J. Vis. Exp. (2018)
このビデオでは、塩抽出およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、タンパク質とDNAの混合懸濁液からプロトタイプ泡沫状ウイルス（PFV）インタソームを精製し、下流解析に使用可能な活性複合体を得る方法を解説します。
