リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）分析用ウイルスRNAの抽出

要約

RT-qPCR（リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応）のためのウイルスサンプルの処理 注：ステップ1.1～1.3は、生物安全キャビネット内で行うこと。特に、感染性ウイルスを含む培養上清の取り扱いは、バイオセーフティレベル2（またはそれ以上）の環境下で実施しなければならない。 1. 199 μLの処理バッファーと1 μLのヌクレアーゼフリープロテナーゼKを混合する。 2. 40 units/mLのRNaseインヒビターを含む細胞培養培地（例：10%胎児牛血清および抗生物質を添加したDMEM [Dulbecco's modified eagle medium] [DMEM/10%胎児牛血清]）を用いて、合成したDENV（デングウイルス）3'UTR（非翻訳領域）RNA（リボ核酸）を1:10で段階希釈し、5 x 10⁹から5 x 10³ copies/μLのRNA標準試料を得る。 3. 8チューブPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）ストリップまたは96ウェルPCRプレートを用い、DENV感染細胞の培養上清5 μLおよびDENV 3'UTR RNA標準試料を、5 μLの処理バッファー/プロテナーゼK溶液と混合する。非テンプレートコントロール（NTC）として、細胞培養培地（ウイルスを含まないもの）5 μLを5 μLの処理バッファー/プロテナーゼK溶液と混合する。 4. 短時間遠心分離した後、サーモサイクラーを用いて以下の条件でサンプルをインキュベートする：1サイクル（25 °Cで10分間、および75 °Cで5分間）。 注：リアルタイムPCR分析を同日に行う場合は、処理済みサンプルを4 °Cで保存できる。長期保存の場合は、サンプルを-80 °Cで保存すること。 鈴木 Y.、 他リアルタイム定量PCR法による感染細胞の培養上清中のデングウイルスRNAの測定。 J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、定量的PCR（Polymerase chain reaction）分析のためのウイルスサンプルの調製手順を説明します。ウイルスサンプルとRNA標準品を段階希釈し、プロテイナーゼKバッファーで処理した後、温度制御下でインキュベーションしてRNAを放出させます。処理されたRNAはその後安定化され、ウイルスRNAレベルの定量のために保存されます。

プロトコル

1. RT-qPCR（リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応）用ウイルスサンプルの処理

注記：ステップ1.1～1.3は、生物安全キャビネット内で行ってください。特に、感染性ウイルスを含む培養上清の取り扱いは、バイオセーフティレベル2（またはそれ以上）の環境下で実施する必要があります。

1. 処理バッファー 199 μL とヌクレアーゼフリー proteinase K 1 μL を混合する。
2. 40 units/mL の RNase インヒビターを含む細胞培養基材（例：10% ウシ胎児血清および抗生物質を添加した DMEM [DMEM/10% ウシ胎児血清]）を用いて、合成した DENV (dengue virus) 3’UTR (Untranslated region) RNA (Ribonucleic acid) を 1:10 で段階希釈し、5 x 10⁹ から 5 x 10³ copies/μL の RNA 標準試料を作成する。
3. 8チューブ PCR (Polymerase chain reaction) ストリップまたは 96ウェル PCR プレートを用いて、DENV 感染細胞の培養上清 5 μL および DENV 3’UTR RNA 標準試料を、処理バッファー/proteinase K 溶液 5 μL と混合する。非鋳型コントロール (NTC) として、細胞培養基材（すなわち、ウイルスを含まないもの） 5 μL を処理バッファー/proteinase K 溶液 5 μL と混合する。
4. 短時間遠心後、サーモサイクラーを用いて以下の条件でサンプルをインキュベートする：1サイクル（25 °C で 10 min、および 75 °C で 5 min）。
注意：リアルタイム PCR 分析を同日に行う場合は、処理済みサンプルを 4 °C で保存できる。長期保存する場合は、サンプルを -80 °C で保存すること。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
SimpliAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A24811	同等のサーマルサイクラーを使用可能だが、PCRサイクルの条件を最適化する必要がある。
Recombinant RNase Inhibitor	Takara Bio. Inc	2313A	40 units/μL
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	同等のRNA精製キットを使用可能。
Proteinase K	Nacalai Tesque	15679-06	>600 units/mL。同等の試薬を使用可能。
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL	Thermo Fisher Scientific	4346907	リアルタイムPCR装置に応じて同等のプレートまたはチューブを使用可能だが、PCRサイクルの条件を最適化する必要がある。