出典: Meister, T. L., et al. 高タイターのE型肝炎ウイルスストックを作製するための細胞培養モデル. J. Vis. Exp. (2020).
このビデオでは、トランスフェクションしたヒト肝細胞癌細胞からE型肝炎ウイルス（HEV）粒子を単離するプロセスを紹介します。細胞外のウイルス粒子はろ過した上清から回収し、細胞内の粒子は細胞を繰り返し凍結融解させることで放出させます。溶解物を遠心分離し、HEV粒子を含む上清を分注して、後で使用するために超低温で保存します。
方法論記事
ヒト肝細胞癌細胞からのE型肝炎ウイルス粒子の回収
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2026年8月31日
この記事について
要約
プロトコル
1. 細胞培養由来HEV（HEVcc）調製のためのHepG2細胞の準備
注記：コンタミネーションを避けるため、細胞の準備、エレクトロポレーション、感染、回収、および細胞固定は、バイオセーフティーレベル2の施設内で無菌状態で実施した。細胞を用いる37 °Cでのインキュベーションステップは、5% CO2 インキュベーター内で行った。
- HEVcc製造用にHepG2細胞を準備するため（図1）、完全Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)（表1参照）を用いて、15 cmコラーゲン（表1参照。コラーゲンを添加する前に、滅菌フィルターで0.2 µmメッシュを用いてリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)-酢酸混合液をろ過すること）コート培養皿に細胞を播種する。細胞が90%コンフルエントになるまで37 °Cでインキュベートする。
注意：90%コンフルエントの細胞を含む15 cm皿1枚につき、最大4回分のエレクトロポレーションに十分な細胞数が得られる。 - プレートから培地を静かに取り除き、10 mLの1x PBSで細胞を1回洗浄する。細胞に0.05% trypsin-EDTAを3 mL添加し、細胞が完全に剥離するまで37 °Cでインキュベートしてトリプシン処理を行う。細胞を10 mLのDMEM完全培地で再懸濁し、細胞懸濁液を50 mLチューブに移す。総細胞数を算出する。
- エレクトロポレーション1回につき5 x 106個の細胞が必要なため、適切な容量を新しい50 mLチューブに移し、1x PBSで少なくとも35 mLまで満たす。細胞を20 x gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを乱さないように注意して上清を捨てる。
- さらに35 mLの1x PBSを用いて、20 x gで5分間、細胞をもう一度洗浄する。細胞を懸濁状態に保つため、1x PBSを除去せずに氷上に置く。
2. HepG2細胞のエレクトロポレーション
- HepG2細胞のエレクトロポレーション（Figure 2）に向けて、1回のエレクトロポレーションあたり40 µLのCytomix completeを調製します。384 µLのCytomix（Table 1参照）に、2 mM ATPおよび5 mM Glutathioneを添加してください。使用直前に調製し、すぐに氷上に置いてください。
注意： 以下の手順を正確かつ迅速に実行することが極めて重要です。したがって、すべての準備を適切に整えておいてください。 - ステップ4.4で得られた細胞ペレットを乱さないように、1x PBSを慎重に取り除きます。5 x 106個の細胞を40 µLのCytomix completeに再懸濁し、5 µg RNAを添加します。この溶液を4 mmキュベットに移し、エレクトロポレーションシステムを用いて975 µF、270 V、20 msで1回パルスを与えます。
- エレクトロポレーション後、パストゥールピペットを用いて、細胞を1回あたり1 mLの完全DMEMにできるだけ速やかに移します。
注意： RNAがHepG2細胞に正常に導入されたかを確認するため、導入コントロール（TC）を実施します。期待される導入率は、ORF2陽性細胞の40-60%です。
- エレクトロポレーション後、パストゥールピペットを用いて、細胞を1回あたり1 mLの完全DMEMにできるだけ速やかに移します。
- エレクトロポレーション後の細胞10 mLを、コラーゲンコートした10 cm培養皿に移します。また、カバースリップを入れたコラーゲンコート24ウェルマイクロプレートの1ウェルに、1.3 x 105個のエレクトロポレーション済み細胞（30 µL）を添加します（これは後に導入コントロールとして使用されます）。細胞を均等に分散させ、37 °Cでインキュベートします。
- 24時間後、10 cm皿の培地を交換し、10 mLの新鮮な完全DMEMに置き換えます。導入コントロールの培地は交換しないでください。その後、37 °Cでさらに6日間インキュベートします。
3. 細胞培養由来HEV (HEVcc) の細胞内および細胞外からの回収
- 細胞外HEVccを回収するために（図3）、6日後に10 cmディッシュから得られた上清を0.45 µmメッシュでろ過し、細胞残渣を除去します。回収した細胞外HEVccは、当日中に感染させる場合は4 °Cで保存し、それ以外の場合は-80 °Cで保存します。
- 細胞内HEVccを回収するために（図3）、細胞を1x PBSで洗浄し、1.5 mLの0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸（trypsin-EDTA）を添加してトリプシン処理します。細胞が完全に剥離するまで37 °Cでインキュベートします。10 mLのcomplete DMEMを加え、プレートをフラッシュして細胞を剥離させ、細胞懸濁液を50 mLチューブに移します。細胞をPBSで2回洗浄します。20 x gで5分間遠心分離します。
- 上清を捨て、エレクトロポレーション1回分につき1.6 mLのcomplete DMEMで細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を2 mL反応チューブに移します。
注意：ウイルス量が大幅に減少するため、より大きな容量を使用しないでください。 - 細胞を凍結（液体窒素中）し、融解させます。この工程を3回繰り返します。
注意：溶解効率が低下するため、3回の凍結融解サイクルのために1回分以上のエレクトロポレーション量（1.6 mL超）をまとめないでください。サイクルの間に細胞懸濁液をボルテックスしないでください。ウイルス量を最大にするため、細胞懸濁液をゆっくりと（例：室温または氷上）融解させてください。 - 溶解した細胞を10,00 x gで10分間高速遠心分離し、細胞残渣を分離します。上清を新しいチューブに移します。この上清を感染に使用するか、それ以外の場合は-80 °Cで保存します。
- オプションとして、濃縮器を使用して細胞外および細胞内HEVccを濃縮し、ウイルス量を増加させます。
- 上清を捨て、エレクトロポレーション1回分につき1.6 mLのcomplete DMEMで細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を2 mL反応チューブに移します。
表 1：バッファー組成表
| 使用液 | 濃縮 | 容量 |
| コラーゲン | 40 mL | PBS |
| 40 µl | 酢酸 | |
| 1 mL | 滅菌済み0.4%コラーゲンR溶液 | |
| Cytomix | 120 mM | KCl |
| 0.15 mM | CaCl₂2 | |
| 10 mM | K2高倍率視野（HPO）4 (pH 7.4) | |
| 25 mM | HEPES | |
| 2 mM | EGTA | |
| DMEM完全培地 | 50 mL | DMEM |
| 5 mL | ペニシリン/ストレプトマイシン | |
| 5 mL | MEM NEAA (10X) | |
| 5 mL | L-グルタミン | |
| 50 mL | 胎児ウシ血清 | |
| MEM完全培地 | 50 mL | MEM |
| 5 mL | ピルビン酸ナトリウム | |
| 5 mL | ゲンタマイシン | |
| 5 mL | MEM NEAA (10X) | |
| 5 mL | L-グルタミン | |
| 50 mL | 低IgG |
結果
図1：細胞培養由来HEV（HEVcc）作製のためのHepG2細胞の準備に関する実験セットアップの概略図。
図2：HepG2細胞のエレクトロポレーションにおける実験セットアップの概略図。
図3：細胞内および細胞外HEVcc回収のための実験スキーム。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.45 µm メッシュ | Sarstedt | 83.1826 | 細胞外ウイルスの回収 |
| MEM | gibco | 31095-029 | 細胞培養 |
| MEM NEAA (10×) | gibco | 11140-035 | 細胞培養 |
| トリプシン-EDTA (0.5 %) | gibco | 15400054 | 細胞培養 |
| 超低IgG | gibco | 192105PJ | 細胞培養 |
| 酢酸 | CarlRoth | 6755.1 | コラーゲン調製液 |
| ATP | Roche | 11140965001 | in vitro転写およびエレクトロポレーション |
| BioRender | BioRender | 図の作成 | |
| 塩化カルシウム | ロス | 5239.2 | Cytomix |
| 0.4% コラーゲンR溶液 滅菌済み | Serva | 47256.01 | コラーゲン調製液 |
| DMEM | gibco | 41965-039 | 細胞培養 |
| EGTA | ロス | 3054.3 | Cytomix |
| GenePulser Xcell エレクトロポレーションシステム | BioRad | 1652660 | エレクトロポレーション |
| HEPES | Invitrogen | 15630-03 | Cytomix |
| リン酸二カリウム | ロス | P749.1 | Cytomix |
| 塩化カリウム | ロス | 6781.3 | サイトミックス |
| リン酸二水素カリウム | ロス | 3904.2 | Cytomix |
| L-グルタミン | gibco | 25030081 | 細胞培養 |
| 還元型L-グルタチオン | Sigma-Aldrich | G4251-5G | Cytomix |
| MEM | gibco | 31095-029 | 細胞培養 |
| MEM NEAA (10×) | gibco | 11140-035 | 細胞培養 |
| 塩化マグネシウム | ロス | 2189.2 | Cytomix |
| 超小型UV-Vis分光度計 NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | DNA/RNA濃度 |
| PBS | gibco | 70011051 | 細胞培養 |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Thermo Fisher | 15140122 | 細胞培養 |
