サンプル収集に関わるすべての手順は、施設のIRBガイドラインに従って実施されました。 1. センダイウイルスによる導入 導入（0日目） 血球を回収して15 mlコニカルチューブに移し、血球計数器を用いてカウントします。 導入1回あたり3 x 10^5個の細胞を用意し、室温（RT）で515 x g、5分間遠心分離します。 上清を吸引して除去し、0.5 mlの血球用培地で細胞を再懸濁します。 細胞を非コートの24ウェルプレートのウェルに移します。 氷上でセンダイウイルス混合液を解凍し、懸濁した細胞に添加します。センダイウイルスの添加量は、製造元の推奨に従ってください。 プレートをシーリングフィルムで密封し、30 °Cで1,150 x g、30分間遠心分離します。 遠心分離後、細胞を37 °C、5% CO2条件下で一晩（O/N）インキュベートします。 フィーダーマトリックスへの細胞移行（1日目） 翌日、24ウェルプレートをビトロネクチンでコートします。ビトロネクチン溶液をPBSで希釈し、最終濃度を5 µg/mlにします。24ウェルプレートのウェルにビトロネクチンを1 ml添加し、室温で少なくとも1時間インキュベートします。使用前にコート液を除去します。コート済みプレートは室温で3日間保存可能です。 細胞とウイルスを含むすべての培地を、コートしたウェルに移します。 残っている細胞をさらに0.5 mlの新鮮な血球用培地で回収し、細胞が入ったウェルに加えます。 プレートを35 °Cで1,150 x g、10分間遠心分離します。 遠心分離後、上清を除去し、iPSC培地を1 ml添加して、37 °C、5% CO2条件下で一晩維持します。 2回目の細胞移行（2日目） ステップ1.2.1で述べた方法で、新しい24ウェルプレートのウェルを5 µg/mlのビトロネクチンでコートします。導入1回につきプレートの1ウェルを使用します。 最初のプレートから細胞懸濁液を、新しくビトロネクチンをコートしたプレートに移します。 注：不要な場合は、懸濁細胞を廃棄しても構いません。ステップ2.3に記載の手順は、懸濁細胞を用いて2～3回繰り返すことができます。手順を繰り返す場合は、細胞を回収してください。 同時に、維持のため、最初のプレートのウェルにiPSC（人工多能性幹細胞）培地を1 ml添加し、37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。 接着した細胞を37 °C、5% CO2条件下で維持し、新鮮なiPSC培地で毎日培地交換を行います。導入後14～21日でコロニーが出現します。 懸濁細胞を含む新しくコートしたプレートを、35 °Cで1,150 x g、10分間遠心分離します。 遠心分離後、細胞を37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。 翌日、上清を除去し、新鮮なiPSC培地と交換します。 注：ステップ1.3に記載の手順は、懸濁細胞を用いて2～3回繰り返すことができます。手順を繰り返す場合は、上清中の細胞を回収し、ステップ1.3を繰り返してください。 接着した細胞を、コンフルエンスが80%に達するまで毎日培地交換して維持します。 Rim, Y. A., 他 センダイウイルスおよび遠心分離を用いた血液細胞からの人工多能性幹細胞の作製 J. Vis. Exp. (2016).
このビデオでは、センダイウイルス媒介のリプログラミングを用いて、ヒト末梢血単核細胞から人工多能性幹細胞（iPSC）を作製する方法を実演します。ウイルス転写因子が多能性ネットワークを活性化し、系統特異的遺伝子を抑制することで、一部の細胞が接着能を獲得し、iPSCコロニーを形成することが可能になります。本プロトコルでは、選択的なマトリックス結合と毎日の培地交換を通じて、これらのリプログラムされた細胞を濃縮および維持します。
