ストレプトアビジンブロッキングアッセイを用いたインフルエンザウイルスの細胞内取り込み能の解析

要約

出典：Pohl, M. O. & Stertz, S. フローサイトメトリーによるA549細胞へのインフルエンザAウイルスの付着および内部移行の測定。J. Vis. Exp. (2015) このビデオでは、ヒト肺上皮細胞において、表面結合したインフルエンザウイルスと内部移行したウイルスを区別するためのストレプトアビジンブロッキングアッセイの使用法を実演します。蛍光信号を比較することにより、インキュベーション後の強度の増加がウイルスの内部移行の成功を示していることがわかります。 Pohl, M. O. & Stertz, S. フローサイトメトリーによるA549細胞におけるインフルエンザAウイルスの吸着および内部移行の測定。 J. Vis. Exp. (2015)

このビデオでは、ヒト肺上皮細胞において、表面に結合したインフルエンザウイルスと細胞内に取り込まれたウイルスを区別するためのストレプトアビジンブロッキングアッセイの使用方法を解説します。蛍光信号を比較することにより、インキュベーション後の強度が高いほど、ウイルスの細胞内取り込みが成功したことを示します。

プロトコル

1. 付着/内部移行アッセイ

注意： アッセイを開始する前に、すべての試薬を準備してください。結果セクションに記載されている3つのコントロール群（模擬感染細胞、ノイラミニダーゼ前処理細胞、およびアジ化ナトリウム処理細胞）については、プロトコルのわずかな変更が必要です。

1. A549細胞を200,000個ずつ含むディープウェルチューブを16本準備する。4本のチューブからなる実験セットのほかに、以下の3つのコントロール条件を用意し、それぞれに4本のチューブを使用する：擬似感染細胞（mock-infected cells）、ノイラミニダーゼ（NA）前処理細胞、およびアジ化ナトリウム処理細胞。各グループは、「0 min」、「0 min + ストレプトアビジン (STV)」、「30 min」、「30 min + STV」とラベル付けされた4本のチューブで構成される。
2. チューブを4 °C、450 x gで3分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを200 µlのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で再懸濁する。
3. チューブを4 °C、450 x gで遠心分離する。上清を除去し、ペレットを0.3% 牛血清アルブミン (BSA)、20 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)、および1% ペニシリン-ストレプトマイシンを含む200 µlのダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)（インキュベーション培地）で再懸濁する。37 °Cで30分間インキュベートする。
   注：ノイラミニダーゼコントロールの場合：インキュベーション培地で希釈した200 mU/ml濃度の細菌性ノイラミニダーゼ（例：Vibrio cholera由来シアリダーゼ）を用いて細胞を再懸濁する。
4. チューブを4 °C、450 x gで3分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを200 µlのPBSで再懸濁する。この工程をもう一度繰り返し、その後、チューブを氷上で10分間冷却する。
5. チューブを4 °C、450 x gで3分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを100 µlのビオチン化ウイルス（セクション2で決定したウイルス濃度を感染用PBSで希釈したもの）で再懸濁する。氷上で1時間インキュベートする。
6. チューブを4 °C、450 x gで3分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを200 µlのPBSで再懸濁する。この工程をもう一度繰り返す。
   注：擬似感染コントロールの場合：ウイルスを含まない感染用PBSを使用する。アジ化ナトリウムコントロールの場合：0.1 % アジ化ナトリウムを添加した感染用PBSで希釈したウイルスを使用する。
7. 氷上での感染後のサンプル処理：
   1. 「0 min」サンプルについては、ステップ2.5に従い、他のサンプルが固定されるまでサンプルを4 °Cで保存する。
   2. 「0 min + STV」サンプルについては、チューブを4 °C、450 x gで3分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを、2% BSAおよび0.1% アジ化ナトリウム（サンプルの操作中の内部移行を防ぐため）を含むPBSで希釈した50 µlのSTV（セクション3で決定した濃度を使用）で再懸濁する。氷上で30分間インキュベートする。
   3. チューブを4 °C、450 x gで3分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを200 µlのPBSで再懸濁する。この工程をもう一度繰り返す。
   4. 固定のため、チューブを4 °C、450 x gで3分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを100 µlの3.7% パラホルムアルデヒド (PFA) で再懸濁する。室温（RT）で10分間インキュベートする。その後、1.6)に記載した洗浄工程を繰り返し、サンプルを4 °Cで保存する。
   5. 「30 min」サンプルについては、チューブを4 °C、450 x gで3分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを2% BSAを含む200 µlのPBSで再懸濁する。37 °Cで30分間インキュベートする。ステップ1.7.3～1.7.4に従い、サンプルを4 °Cで保存する。
      注：アジ化ナトリウムコントロールの場合：37 °Cでの30分間のインキュベーションには、2 % BSAおよび0.1 % アジ化ナトリウムを添加したPBSを使用する。
   6. 「30 min + STV」サンプルについては、チューブを4 °C、450 x gで3分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを2% BSAを含む200 µlのPBSで再懸濁する。37 °Cで30分間インキュベートする。その後、チューブを4 °C、450 x gで3分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを、2% BSAおよび0.1% アジ化ナトリウム（サンプルの操作中の内部移行を防ぐため）を含むPBSで希釈した50 µlのSTV（セクション3で決定した濃度を使用）で再懸濁する。氷上で30分間インキュベートする。ステップ1.7.3～1.7.4に従い、サンプルを4 °Cで保存する。
      注：アジ化ナトリウムコントロールの場合：37 °Cでの30分間のインキュベーションには、2 % BSAおよび0.1 % アジ化ナトリウムを添加したPBSを使用する。
8. 透過処理のため、チューブを4 °C、450 x gで3分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを0.5% Triton X-100を含む100 µlのPBSで再懸濁する。室温（RT）で6分間インキュベートする。その後、1.6)に記載した洗浄工程を繰り返す。
9. チューブを4 °C、450 x gで3分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを、STV-Cy3を含むPBSで希釈した50 µlの2% BSAで再懸濁する。（注意：STV-Cy3の適切な濃度は、実験開始前に決定しておく必要がある。まず1:200の濃度から開始し、1:2,400まで2倍希釈でテストすること。本検討では、1:1,000の希釈が最適であることが確認された。）
10. 室温（RT）の暗所で1時間インキュベートする。その後、1.6)に記載した洗浄工程を繰り返すが、ペレットはPBSで希釈した200 µlの2% BSAで再懸濁する。
11. フローサイトメトリーでサンプルを分析する。各サンプルにおけるCy3陽性細胞の割合を決定する。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	Life Technologies	41966-052
FBS	Life Technologies	10270-106
ペニシリン-ストレプトマイシン	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-100
D-スクロース	Fluka	84100
Bio Rad Protein Bio Assay	Bio Rad	500-0006
ディープウェルチューブ（1.2 ml マイクロチューブ）	Milian	82 00 001
PFA	Lucerna chem Electron microscopy sciences	15710
超遠心管	Hemotec HmbH	253070
Triton X-100	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
アジ化ナトリウム	Fluka	71290
細菌性ニューラミニダーゼ/シアリダーゼ	Sigma-Aldrich	N6514-1UN