吸光度測定を用いたファージによる細菌増殖抑制の評価

要約

出典： Niu, Y. D.、他 ハイスループット設定を用いた、食中毒起因菌のバイオコントロールにおけるバクテリオファージの有効性評価。 J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、E.coli細菌培養物に対するファージカクテルの溶菌活性を評価するためのマイクロプレートベースのアッセイを紹介します。吸光度の変化によって、ファージの力価および完全な細菌抑制に必要な濃度がどのように明らかになるかを解説します。

プロトコル

1. バッファーおよび試薬の調製

1. トリプチックソイブロス（TSB）（TSB粉末 15 gと超純水 500 mL）を500 mL調製し、オートクレーブ滅菌する。
   注意：これは室温で最大3か月間、または4 °Cで最大6か月間保存可能である。
2. トリプチックソイアガー（TSA）（TSA粉末 20 gと超純水 500 mL）を500 mL調製し、オートクレーブ滅菌する。
   注意：これは4 °Cで最大3か月間保存可能である。
3. リン酸緩衝生理食塩水（PBS；NaCl 4 g、KCl 0.1 g、Na₂HPO₄ 0.77 g、KH₂PO₄ 0.12 g、超純水 500 mL）を500 mL調製し、25 °CでpHを 7.2 ± 0.2 に測定および調整した後、オートクレーブ滅菌する。
   注意：これは4 °Cで最大6か月間保存可能である。
4. 1 M MgSO₄（49.294 gと超純水 200 mL）を200 mL調製し、0.22 µmポリエーテルスルホンフィルターでろ過滅菌する。
5. 10 mM MgSO₄含有TSB（mTSB；TSB粉末 15 g、超純水 500 mL、1 M MgSO₄ 5 mL）を500 mL調製し、オートクレーブ滅菌する。滅菌後の培地を室温まで冷却させる。無菌操作を行う。セロロジカルピペットを用いて、1 M MgSO₄ 5.0 mLを慎重に分注し、静かに回旋させて混合する。

2. 細菌培養液の調製

1. 細菌研究室培養物（BRLC）を調製するため、グリセロールストックバイアルをフリーザーから取り出し、研究室へ移動させる。
2. 使い捨ての接種ループまたは同等の器具を用い、バイアルに浸して接種源（凍結スラッシュ）を少量採取し、レベルIIバイオセーフティキャビネット内でTSAプレートまたは同等のプレートに画線する。プレートを37 ± 2 °Cで15−18時間培養する。
3. 調製したBRLCプレートを袋に入れ、4 °Cで保存する。
   注：BRLCの一般的な有効期限は、調製後4 °Cで14日間である。
4. テスト対象となるBRLCプレートから各E. coli O157株の単一コロニーを10 mLのTSBに接種し、37 °Cで18時間静置培養して9 log10 CFU/mLに到達させる。
5. 翌朝、10 mMのMgSO₄を含むmTSBを用いて、各E. coli O157株の overnight培養液を連続希釈し、4-5 log10 CFU/ml（またはその他の目的の接種レベル）にする。
6. 各株のovernight培養液を等量ずつ混合し、合計で4-5 log10 CFU/mL（または目的の濃度）となるようにして、細菌混合液を調製する。
7. 希釈した細菌培養液を直ちに4 °Cに置き、使用時まで保管する。
8. 接種源培養液を10倍または100倍に希釈し、これらの希釈液を0.1 mLずつTSAプレートに分注して、単一コロニーを得る。

3. ファージ作動液の調製

1. 標準的な方法4に従い、スクリーニング対象となる各ファージの高タイター作業ストック（≥10^8 PFU/mL）を増殖させる。
   注： ファージストックの一般的な有効期限は、プラスチックボトルにて保存した場合で3か月間であり、保存温度は 4 °C 生成後。
2. 例えば～10^xのような目的のタイターを得るためには、⁸ 溶菌速度論のためのPFU/mLを得るには、10 mMのMgSO4を含むmTSBを用いて個々のファージ調製液を希釈し、₄同一力価の各ワーキングストックを、考えられるすべての組み合わせで等量ずつ混合し、ファージカクテルを調製する。

4. 個別のファージおよびファージカクテルのin-vitro溶菌キネティクスの調製

1. 滅菌済みの96ウェルマイクロプレートの1〜8列目に、各ファージの10倍段階希釈系列を調製し、マイクロプレートアッセイをセットアップする。
   注： 1つの細菌株に対する4種類のファージを、各プレートの隣接する列で2連（duplicate）で試験できる。残りの4列は、ファージなしのコントロールおよびmTSBブランク用とする（Figure 1）。
2. 96ウェルマイクロプレートの1〜12列目のウェルに、mTSBを180 µLずつ分注する。
3. マイクロプレートの最上段（Row A）の1〜8ウェルに、希釈した個別のファージまたはファージカクテル（~108 PFU/mL）を20 µLずつ加える。
4. ファージフリーコントロールおよびブランクコントロールとして、9、10、11列目の最上段ウェルにmTSBを20 µLずつ加える。
5. 12チャンネルピペットを用いて、プレート内で希釈を行う。20 µLずつ行から行へと移していく。緩やかな吸引と吐出（少なくとも5回）を繰り返し、内容物を十分に混合させ、希釈段階ごとにチップを交換する。最終行（Row H）から20 µLを除去する。
   注： クロスコンタミネーションを防ぐため、フィルター付きチップの使用を推奨する。
6. 菌株ごとにリザーバーを用意する。1 mLピペットを用いて、希釈した培養液2-3 mLをリザーバーに移す。1〜10列目について、マルチチャンネルピペットを用いて、希釈した細菌培養液を各ウェルに20 µLずつ加える。添加ごとにチップを交換する。
7. マイクロプレートに蓋をし、任意の条件（例：37 °Cで10 h、または22 °Cで22 h）でインキュベートする。
8. 2 hまたはその他の任意の時間間隔で、マイクロプレートをインキュベーターから取り出す。

結果

図1：96ウェルマイクロプレートアッセイの推奨レイアウト。各ファージの10倍段階希釈液を、滅菌済み96ウェルマイクロプレートの列1〜8に調製します。1つの細菌株に対する4種類のファージを、各プレートの隣接する列で2連（デュプリケート）でテストできます。残りの列はコントロールに使用します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
必須の消耗品、試薬および装置
硫酸マグネシウム七水和物	シグマ	1374361
Pipet-Lite LTS ピペット L-1000XLS+	METTLER TOLEDO	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+	METTLER TOLEDO	17014405
Pipet-Lite マルチピペット L12-20XLS+	METTLER TOLEDO	17013808
Pipet-Lite ピペット, Unv. SL-20XLS+	METTLER TOLEDO	17014412
ピペットチップ RT LTS 1000µL FL 768A/8-低吸着	METTLER TOLEDO	30389213
ピペットチップ SR LTS 20µL F 960A/5	METTLER TOLEDO	17005860
リザーバー	METTLER TOLEDO	89094-662
蓋付きの滅菌済み透明96ウェル平底ポリスチレン製マイクロプレート	Fisher	168055
トリプチックソイ寒天 (TSA)	シグマ	105458-0500
トリプチックソイブロス（TSB）	シグマ	105459-0500
T字型セルスプレッダー	VWR	76299-566
使用器具
小型微生物インキュベーター	Fisher	50125590H
多角形スターラーバー	Fisher	14-512-125	長さ：20 mm
Synergy Neo2 ハイブリッド マルチモードリーダー	Fisher	BTNEO2M
ソフトウェア
SAS	SAS Institute	9.4