方法論記事

器官型海馬切片培養

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DOI：

10.3791/2462

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2011年2月3日

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Washington School of Medicine

この記事について

サマリー

我々は簡単に他の脳領域に適合させることができる器官型海馬切片を調製する方法を説明します。脳スライスは、インタフェースを形成するために許可されている多孔質膜と培地上に置かれている。このメソッドは、最大の文化の2週間までの海馬の総アーキテクチャを保持します。

要約

海馬、大脳辺縁系の構成要素は、長期記憶と空間ナビゲーション1の重要な役割を果たしている。海馬ニューロンは、強力な活性化の短い期間の後にその接続の強さを変更することができます。長期増強（LTP）と呼ばれるこの現象は、数時間または数日間続く ​​ことができますし、学習と記憶2の最良の候補メカニズムとなっています。さらに、海馬3のよく定義された解剖学との接続は、そのシナプス伝達とシナプス可塑性の4を研究する古典的なモデルシステムてきた。

海馬シナプスの生理学の理解が成長し、分子の選手は、識別されたになるにつれ、シナプスタンパク質を操作する必要性が不可欠となった。器官型海馬培養が容易な遺伝子操作と正確な薬理学的介入の可能性を提供しますが、日常的な文化解離ニューロンの方法よりも自然な文脈におけるシナプス機能を理解する上で重要であるシナプスの組織を維持する。

ここでは簡単に他の脳領域に適合させることができる海馬スライスを準備し、文化に方法を提示する。このメソッドは、ウイルス感染5,6またはbiolistics 7のようなさまざまなアプローチを用いて遺伝子操作のためのスライスに簡単にアクセスできます。さらに、スライスを簡単に生化学的ア ​​ッセイ8用に回収できる、またはイメージング9または電気生理学的実験10の顕微鏡に転送する。

プロトコル

1。海馬スライスの準備を開始する前に。

  1. テフロンシートの部分を置き、新​​しいブレードを取り付けることで、組織スライサーを準備します。
  2. 70％エタノールで組織培養（TC）フードを拭き、解剖顕微鏡の内部に設定してください。フード、顕微鏡、組織スライサーおよびUV光で15分間すべての解剖器具を滅菌する。
  3. シックスウェルTCプレートを準備します。各ウェルに750μLのスライス培養培地（SCM）ウェルあたりと場所​​細胞培養インサートを追加。膜が下にない泡で十分に濡れていることを確認してください。 35℃インキュベーターでプレートを置きます°必要になるまで、5％CO 2でガス処刑。
  4. 100mLのビーカーに50mLの低Na +の ACSFを（解決策を解剖）注ぎ、氷塩ミックスの上に置きます。色の変化とACSFが凍結し、液体溶液（10〜20分）のスラリーの混合を形成するまで5％CO 2 / 95％O 2とバブル低Na +の ACSF。
  5. P5 - P7のラットは、子犬得る。最大3つの仔を使用することができます。

2。海馬スライスの準備。

  1. シャープのユーティリティはさみで動物の頭をカット。皮膚をカットし、頭蓋骨を公開。両耳間のラインに沿って、その後、小さなはさみで矢状縫合に沿って左右にカットして頭蓋骨を開きます。フロントの左右にオプションのカットは、骨と脳の露出を除去する容易にするために行うことができます。丸いスプーンミクロスパチュラで迅速に脳をかき出すと、約1分間冷却する為のソリューションを解剖のスラリーに入れてください。 〜60mmの皿に氷冷解剖溶液10 mLを入れ、ビーカーから皿に脳を転送する。脳は、解剖ソリューションでカバーされるべきである。
  2. 解剖顕微鏡の下：脳を置き、60mmの皿の底に押さ解剖ピンセットで正中線でそれを保持する。中脳を残して半球を分けるために海馬解剖ツールを使用してください。海馬は、それぞれの半球で公開されています。その後そっとツールを解剖海馬と海馬をかき出す。完全に海馬を分離し、可能な限りそれをきれいに解剖針を使用してください。
  3. P1000フィルターピペットチップのsnipped先端を使用して、ゆっくりと海馬を吸引除去し、組織のスライサーにテフロンシートに転送します。その凹面側の海馬を置きます。
  4. 冠状のセクションを取得し、液体の過剰を排出するためにブレードに海馬の垂直位置を合わせます。
  5. 海馬は、400μmのスライス。
  6. 別のsnipped P1000フィルターチップとコールドSCMを使用してスライサーから海馬をスライスした60mmディッシュと転送に約10 mLの冷SCMを注ぐ。泡を作ることは避けてください。
  7. アイリスのヘラとストレートヘラの助けを借りてそっとお互いのスライスを切り離す。
  8. 明確に定義し、破損していないスライスは、破損したスライスから区切ります。

3。海馬スライスの文化

  1. インキュベーターからSCMや細胞培養インサートで6 - ウェルプレートを持参。別のsnipped P1000フィルターチップの助けを借りて、メンブレンに個々のスライスを転送する。膜4〜5のスライスを置きます。スライスのいずれかのインサート壁に近づけたり、互いに近くに配置しないように注意してください。必要な場合には、別のスライスにアイリスのヘラを使用してください。余分な培地を取り外します。彼らは細胞膜上に存在したら、できるだけ少ないとしてスライスをタッチ。
  2. 35でバックインキュベーターにプレートと文化を移動℃、5％CO 2。
  3. パスツールピペットでSCMを吸引することによってTCのフード内SCM、48時間毎に変更する。ウェル当たりの新鮮予め温めておいたSCMを750μLを加える。は気泡が膜の下に形成されていないことを確認してください。

4。ソリューション

  1. ローのNa + ACSF -スライス培養のための解剖ソリューション
    イオンと滅菌H 2 Oを追加するには：
    500mLのための 1000mLのための 最終濃度
    のCaCl 2（1 M） 0.5mLの 1 mLの 1mMの
    D -グルコース 0.901グラム 1.802グラム 10 mMの
    塩化カリウム 0.149グラム 0.298グラム 4mMの
    MgCl 2の （1 M） 2.5mLの 5 mLの 5mMの
    NaHCO 3の 1.092グラム 2.184グラム 26mmの
    スクロース 40グラム 80グラム 234 mMの
    DPBSでフェノールレッド溶液0.5パーセント 0.5mLの 1 mLの 0.1パーセントV / V

    ミックス〜30分
    滅菌0.22μmフィルターを通過させることによってIZE
    2ヶ月以上を50mL分注し、4℃で保存されなくてください。
  2. スライス培養培地（SCM）
    500mLのための 1000mLのための 最終濃度
    MEMイーグル培地 4.2グラム 8.4グラム 8.4グラム/リットル
    不活化ウマ血清熱 100mLの 200 mLの 20パーセント
    L -グルタミン（200mMの） 2.5mLの 5 mLの 1mMの
    のCaCl 2（1 M） 0.5mLの 1 mLの 1mMの
    MgSO 4を （1 M） 1 mLの 2 mLの 2mMの
    塩酸0.01 Nに溶解インスリン（1 mg / mL）は、 0.5mLの 1 mLの 1mg / lの
    アスコルビン酸、溶液（25％w / v）の 0.024 mLの 0.048 mLの 0.00125%
    D -グルコース 1.16グラム 2.32グラム 13 mmの
    NaHCO 3の 0.22グラム 0.44グラム 5.2 mMの
    HEPES 3.58グラム 7.16グラム 30mMの

    完全に溶解するまで混合し、室温にもたらす。
    1 N NaOHで7.27から7.28にpHを調整する
    浸透圧を測定します。脱イオン滅菌H 2 Oで320ミリモル/ kgに調整する約25〜40 mLを追加する予定。再び浸透圧を確認してください。
    浸透圧を調整しながら*** pHが若干変更される可能性がある、これはOKです、それは浸透圧が正しい範囲（317〜323）になっていることより重要です。
    0.22μmフィルターを通過させることによって滅菌する。
    4で二から三週間までに20 mLのアリコートとストアを行います℃に
    Gluatamineの株式：2.5 mLのアリコートで-20℃で200mmと店舗の濃度で準備する。
    アスコルビン酸の株式：25％の濃度（w / v）で準備し、100μLのアリコートで-20℃で保存されている。

5。代表的な結果：

スライスは黒い斑点なし解剖範囲で白く見えるとよく定義されており、無傷のCA1、CA3、および歯状回領域があります。細菌汚染を簡単にSCMの培地や濁度に黒の斑点を移動すると見られている。顕微鏡下に置かれたとき、スライスの表面には、はっきりと目に見えて細胞体と培養中の4日後にきれいになるはずです。明確な細胞体は見られないと多くの破片が4日後に表面を覆っている場合は、健全なスライスではありません。

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ディスカッション

このメソッドは、 最初のStoppini らの方法に基づいて11および文化海馬スライスへの迅速な方法を提供しています。このプロトコルの最も重要な側面は、スライスが無菌維持することであるため、それは適切な無菌テクニックを使用するために、適切に組織と接触するすべての素材を消毒殺菌することが重要です。

異なる血清源は、スライスの品質に影響を与えることができる。まず、いくつかのバッチをテストすることをお勧めします。汚染が再発問題がある場合は、インキュベーターや汚染源となる可能性のための組織培養フードを確認してください。全体の手順の実行中に無菌テクニックの適切な使用が不可欠です。

断頭から膜上とインキュベーター内のスライスを配置する合計時間は1.5時間を超えるべきではない。手続きに時間がかかりすぎると、それは、スライスの健康が損なわれます。

毛管現象によって形成されているSCMの薄い層を介して多孔質膜の保証適切な酸素と栄養上...

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開示事項

利害の衝突は宣言されません。

謝辞

この作品は、NINDSによって賄われていた - NIH R01NS060756を

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
細胞培養用インサートEMD MilliporePICM03050
6ウェルプレートBD Biosciences353046
組織スライサーStoelting Co.51425/51415
顕微鏡オリンパス株式会社SZX7-ILLD2-100
海馬解剖用ツールF.S.T.10099-15
大型ユーティリティシザース (Perfection)F.S.T.37500-00/37000-00 右手用/ 左手用
アイリススパチュラF.S.T.10093-13
ストレートスパチュラF.S.T.10094-13
丸匙マイクロスパチュラVWR international57949-039
解剖用単刃切断針Electron Microscopy Sciences72946
解剖用ピンセットDumont#2
小型解剖用鋏F.S.T.14060-10
MEM Eagle培地Cellgro50-019 PB
馬血清（非動化）Invitrogen26050-88
L-グルタミン (200 mM)Invitrogen25030081
CaCl2 (1 M)Sigma-AldrichC3881
MgSO4 (1 M)Sigma-AldrichM2773
インスリン (1 mg/ml)、0.01 N HClに溶解Sigma-AldrichI0516
アスコルビン酸溶液 (25%)Sigma-AldrichA4544
D-グルコースSigma-AldrichG5767
NaHCO3Sigma-AldrichS6014
HepesSigma-AldrichH7523
ショ糖Sigma-AldrichS5016
フェノールレッド溶液 (DPBS中 0.5%)Sigma-AldrichP0290
KClSigma-AldrichP3911
MgCl2 (1 M)Sigma-AldrichM9272

参考文献

  1. Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
  2. Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. ntroduction Long-term potentiation and structure of the issue. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).
  3. Shepherd, G. M. The synaptic organization of the brain. , 5th edn, University Press. Oxford. (2004).
  4. Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
  5. Malinow, R. Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
  6. Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105, 331-343 (2001).
  7. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
  8. Esteban, J. A. PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity. Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).
  9. Mainen, Z. F. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18, 231-239 (1999).
  10. Barria, A., Malinow, R. Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses. Neuron. 35, 345-353 (2002).
  11. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  12. Simoni, A. D. e, Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).

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