我々は簡単に他の脳領域に適合させることができる器官型海馬切片を調製する方法を説明します。脳スライスは、インタフェースを形成するために許可されている多孔質膜と培地上に置かれている。このメソッドは、最大の文化の2週間までの海馬の総アーキテクチャを保持します。
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この記事について
サマリー
要約
海馬、大脳辺縁系の構成要素は、長期記憶と空間ナビゲーション1の重要な役割を果たしている。海馬ニューロンは、強力な活性化の短い期間の後にその接続の強さを変更することができます。長期増強（LTP）と呼ばれるこの現象は、数時間または数日間続く ことができますし、学習と記憶2の最良の候補メカニズムとなっています。さらに、海馬3のよく定義された解剖学との接続は、そのシナプス伝達とシナプス可塑性の4を研究する古典的なモデルシステムてきた。
海馬シナプスの生理学の理解が成長し、分子の選手は、識別されたになるにつれ、シナプスタンパク質を操作する必要性が不可欠となった。器官型海馬培養が容易な遺伝子操作と正確な薬理学的介入の可能性を提供しますが、日常的な文化解離ニューロンの方法よりも自然な文脈におけるシナプス機能を理解する上で重要であるシナプスの組織を維持する。
ここでは簡単に他の脳領域に適合させることができる海馬スライスを準備し、文化に方法を提示する。このメソッドは、ウイルス感染5,6またはbiolistics 7のようなさまざまなアプローチを用いて遺伝子操作のためのスライスに簡単にアクセスできます。さらに、スライスを簡単に生化学的ア ッセイ8用に回収できる、またはイメージング9または電気生理学的実験10の顕微鏡に転送する。
プロトコル
1。海馬スライスの準備を開始する前に。
- テフロンシートの部分を置き、新しいブレードを取り付けることで、組織スライサーを準備します。
- 70％エタノールで組織培養（TC）フードを拭き、解剖顕微鏡の内部に設定してください。フード、顕微鏡、組織スライサーおよびUV光で15分間すべての解剖器具を滅菌する。
- シックスウェルTCプレートを準備します。各ウェルに750μLのスライス培養培地（SCM）ウェルあたりと場所細胞培養インサートを追加。膜が下にない泡で十分に濡れていることを確認してください。 35℃インキュベーターでプレートを置きます°必要になるまで、5％CO 2でガス処刑。
- 100mLのビーカーに50mLの低Na +の ACSFを（解決策を解剖）注ぎ、氷塩ミックスの上に置きます。色の変化とACSFが凍結し、液体溶液（10〜20分）のスラリーの混合を形成するまで5％CO 2 / 95％O 2とバブル低Na +の ACSF。
- P5 - P7のラットは、子犬得る。最大3つの仔を使用することができます。
2。海馬スライスの準備。
- シャープのユーティリティはさみで動物の頭をカット。皮膚をカットし、頭蓋骨を公開。両耳間のラインに沿って、その後、小さ....
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ディスカッション
このメソッドは、 最初のStoppini らの方法に基づいて11および文化海馬スライスへの迅速な方法を提供しています。このプロトコルの最も重要な側面は、スライスが無菌維持することであるため、それは適切な無菌テクニックを使用するために、適切に組織と接触するすべての素材を消毒殺菌することが重要です。
異なる血清源は、スライスの品質に影響を与えることができる。まず、いくつかのバッチをテストすることをお勧めします。汚染が再発問題がある場合は、インキュベーターや汚染源となる可能性のための組織培養フードを確認してください。全体の手順の実行中に無菌テクニックの適切な使用が不可欠です。
断頭から膜上とインキュベーター内のスライスを配置する合計時間は1.5時間を超えるべきではない。手続きに時間がかかりすぎると、それは、スライスの健康が損なわれます。
毛管現象によって形成されているSCMの薄い層を介して多孔質膜の保証適切な酸素と栄養上.......
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
この作品は、NINDSによって賄われていた - NIH R01NS060756を
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 細胞培養用インサート | EMD Millipore | PICM03050 | |
| 6ウェルプレート | BD Biosciences | 353046 | |
| 組織スライサー | Stoelting Co. | 51425/51415 | |
| 顕微鏡 | オリンパス株式会社 | SZX7-ILLD2-100 | |
| 海馬解剖用ツール | F.S.T. | 10099-15 | |
| 大型ユーティリティシザース (Perfection) | F.S.T. | 37500-00/37000-00 右手用/ 左手用 | |
| アイリススパチュラ | F.S.T. | 10093-13 | |
| ストレートスパチュラ | F.S.T. | 10094-13 | |
| 丸匙マイクロスパチュラ | VWR international | 57949-039 | |
| 解剖用単刃切断針 | Electron Microscopy Sciences | 72946 | |
| 解剖用ピンセット | Dumont | #2 | |
| 小型解剖用鋏 | F.S.T. | 14060-10 | |
| MEM Eagle培地 | Cellgro | 50-019 PB | |
| 馬血清（非動化） | Invitrogen | 26050-88 | |
| L-グルタミン (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | |
| CaCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4 (1 M) | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| インスリン (1 mg/ml)、0.01 N HClに溶解 | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| アスコルビン酸溶液 (25%) | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| D-グルコース | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| ショ糖 | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| フェノールレッド溶液 (DPBS中 0.5%) | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgCl2 (1 M) | Sigma-Aldrich | M9272 |
参考文献
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. ntroduction Long-term potentiation and structure of the issue. Phi....
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再版と許可
