ヌクレオシドアナログを用いた複製中HSV-1ゲノムの標識

要約

1. 細胞培養、ウイルス感染およびEdC（5-エチニル-2′-デオキシシチジン）標識（図1） 以下のプロトコルではウイルスを取り扱います。ウイルスおよびその他の生物学的製剤の安全な取り扱いに関しては、所属機関のバイオセーフティプロトコルを参照してください。本プロトコルは、ピッツバーグ大学の制度審査委員会の承認を受けています。 コンフルエントな150 cm2の組織培養フラスコ内のMRC-5（Medical Research Council細胞株5）細胞をトリプシン処理し、10 mLのDMEM（Dulbecco・改良イーグル培地）に10% FBSを加えたものを含む600 cm2の組織培養プレートに細胞を移します。37 °C、5% CO2条件下で3〜4日間培養し、コンフルエントおよび定常期に到達させます。コンフルエントな60 cm2のディッシュには約7 x 107個の細胞が含まれます。各条件につき1枚のプレートを、および対応する各陰性対照につき1枚のプレートを用意します。 注：後続のステップでウイルスDNA（vDNA）のみが標識および精製されるようにするためには、細胞のDNA複製を抑制するために細胞を定常期に到達させる必要があります。 注：各サンプルには、EdCを添加せずに、同一の感染条件およびタイムポイントを用いて調製した相補的な未標識陰性対照が必要です。 注：相当する細胞増殖、感染、EdC標識条件およびタイムポイントを用いて、細胞DNAの標識をイメージングで確認するための縮小版実験を並行して実施してください（ステップ2を参照）。 7 x 108 PFU（プラーク形成単位）のHSV-1を、7 mLの冷PBS（Tris緩衝生理食塩水）で希釈します。増殖培地を除去し、37 °Cで保持します。感染させるには、希釈したウイルス7 mLをMRC-5細胞に加え、室温で1時間揺動させます。吸着後、接種液を除去し、室温のTBS 50 mLで洗浄し、元の増殖培地を補充します。37 °C、5% CO2条件下で培養します。このステップを各実験条件および陰性対照に対して実施してください。 注：ウイルスdUTPase（UL50遺伝子）および/またはウラシル配糖体分解酵素（UL2遺伝子）の発現が欠損したHSV-1変異株を使用することで、EdC標識の効率を高めることができます。HSV-1 dUTPaseは基質特異性が低く、いくつかのヌクレオシドアナログの活性化を低下させる可能性があります。 EdCでウイルスゲノムを標識します。侵入ゲノム（1.3.1.）、複製ゲノム（1.3.2.）、またはウイルス複製フォーク（1.3.3.）の標識に関する指示に従ってください。 注：後続のステップで侵入ゲノム、複製ゲノム、または複製フォークのいずれを解析するかに応じて、ステップ1.3.1、1.3.2、または1.3.3のいずれかのみを実施してください。 注：EdCの代わりにEdUまたはf-ara EdUを代用できます。ヌクレオシドアナログの毒性を監視し、最小限に抑える必要があります。 未複製vDNAを調査する場合（図1A）、あらかじめ標識したストックを用いてステップ1.2の感染を行い、感染後（hpi）4時間以内にステップ2または3に進んでください。 注：既報のプロトコル25を用いて標識ウイルスストックを調製してください。ウイルスストックは、残留EdCを除去するためにG-25カラムに通す必要があります。 感染細胞の細胞培養培地に5〜25 µMのEdCを2〜4時間添加して、複製中のvDNAを標識します（図1B）。添加前に、EdCを1 mLの増殖培地で希釈してください。 ウイルス複製フォークを標識するには、vDNA複製が開始した後（4 hpi以上）、複製中のvDNAを5〜25 µMのEdCで5〜20分間パルス標識します。チェイスを行うには、25〜100 µMの2´-デオキシシチジン（deoxyC）を含むチェイス培地で3回洗浄し、その後、チェイス培地中でさらに20〜40分間培養します（図1C）。 注：パルスおよびチェイス培地は、使用前に37 °C、5% CO2で平衡化させてください。 注：パルスチェイス実験では、ヌクレオシドが細胞内に取り込まれ、複製DNAに組み込まれる前にリン酸化されるまでにかかる時間を考慮することが重要です。これは経験的に決定する必要があります。 注：パルスチェイス実験の分解能を決定するために、使用した実験条件下でのウイルス複製率を算出してください。これは、シングルステップ増殖タイムコース中のウイルスゲノムの定量PCRによって決定できます。 Dembowski, J. A., Deluca, N. A. 結合するウイルスおよび細胞タンパク質の同定に向けたウイルスDNAの精製. J. Vis. Exp. (2017)

このビデオでは、定常期の哺乳類細胞にHSV-1（単純ヘルペスウイルス1型）を感染させ、その後、宿主およびウイルスの複製機構を用いてウイルスゲノムを複製させる方法を示します。合成ヌクレオシド類似体を新しく合成されたウイルスDNAに取り込ませて複製中のゲノムを標識し、その後、これを単離して、結合している宿主およびウイルス蛋白質のプロテオミクス解析を行います。

プロトコル

1. 細胞培養、ウイルス感染、およびEdC (5-Ethynyl-2′-deoxycytidine) ラベル化（図 1）

以下のプロトコルではウイルスを取り扱います。ウイルスおよびその他の生物学的剤の安全な取り扱いに関しては、所属機関のバイオセーフティプロトコルを参照してください。本プロトコルは、ピッツバーグ大学の制度的審査委員会（Institutional Review Board）によって承認されました。

1. コンフルエントな150 cm² 組織培養フラスコ内のMRC-5（Medical Research Council cell strain 5）細胞をトリプシン処理し、10 mLのDMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）に10% FBSを添加した60 cm2 組織培養プレートに細胞を移す。37 °C、5% CO₂条件下で3～4日間インキュベートし、コンフルエンスおよび静止期に到達させる。コンフルエントな60 cm2 ディッシュには約7 x 10⁷ 個の細胞が含まれる。各条件につき1プレート、および対応する各ネガティブコントロールにつき1プレートを用意する。
   注： 後続のステップにおいてvDNA（ウイルスDNA）のみが標識および精製されるようにするためには、細胞のDNA複製を抑制するために細胞を静止期に到達させる必要がある。
   注： 各サンプルには、EdCを添加せずに、同一の感染条件およびタイムポイントで調製した相補的な未標識ネガティブコントロールが必要である。
   注： 比較可能な細胞増殖、感染、EdC標識条件、およびタイムポイントを用いて、イメージングによる細胞DNAの標識を検証するために、この実験のスケールダウン版を並行して実施すべきである（ステップ2を参照）。
2. 7 x 10⁸ PFU（プラーク形成単位）のHSV-1を7 mLの冷TBS（Tris緩衝生理食塩水）で希釈する。増殖培地を除去し、37 °Cで保存する。感染させるには、7 mLの希釈ウイルスをMRC-5細胞に加え、室温で1時間ロッキングする。吸着後、接種液を除去し、室温のTBS 50 mLで洗浄し、元の増殖培地を再添加する。37 °C、5% CO₂条件下でインキュベートする。このステップを各実験条件およびネガティブコントロールに対して行う。
   注： ウイルスdUTPase（UL50遺伝子）および/またはウラシル配糖体分解酵素（UL2遺伝子）の発現に欠損のあるHSV-1変異株を用いることで、EdC標識を増強できる。HSV-1 dUTPaseは基質特異性が低いため、いくつかのヌクレオシドアナログの活性化を低下させる可能性がある。
3. EdCを用いてウイルスゲノムを標識する。流入ゲノム（1.3.1.）、複製ゲノム（1.3.2.）、またはウイルス複製フォーク（1.3.3.）の標識に関する指示に従う。
   注： 後続のステップで、流入ゲノム、複製ゲノム、または複製フォークのいずれを解析するかに応じて、ステップ1.3.1、1.3.2、または1.3.3のいずれかのみを実施すること。
   注： EdCの代わりにEdUまたはf-ara EdUを代用できる。ヌクレオシドアナログの毒性をモニタリングし、最小限に抑える必要がある。
   1. 未複製vDNAを調べるには（図1A）、あらかじめ標識したストックを用いてステップ1.2の感染を行い、感染後（hpi）4時間以内にステップ2または3に進む。
      注： 既報のプロトコル25に従って、あらかじめ標識したウイルスストックを調製すること。ウイルスストックは、残留EdCを除去するためにG-25カラムに通さなければならない。
   2. 感染細胞の細胞培養培地に5 - 25 µM EdCを2～4時間添加することにより、複製vDNAを標識する（図1B）。添加前に、EdCを1 mLの増殖培地で希釈する。
   3. ウイルス複製フォークを標識するには、vDNA複製の開始後（≥4 hpi）、5 - 25 µM EdCを用いて複製vDNAを5～20分間パルス標識する。チェイスを行うには、25 - 10 µM 2´-デオキシシチジン（deoxyC）を含むチェイス培地で3回洗浄し、その後、チェイス培地存在下でさらに20～40分間インキュベートする（図1C）。
      注： パルスおよびチェイス培地は、使用前に37 °C、5% CO₂条件下で平衡化させておくべきである。
      注： パルスチェイス実験では、ヌクレオシドが細胞内に取り込まれ、複製DNAに組み込まれる前にリン酸化されるまでに要する時間を考慮することが重要である。これは経験的に決定しなければならない。
      注： パルスチェイス実験の解像度を決定するには、使用した実験条件下でのウイルス複製速度を算出する。これは、シングルステップ増殖タイムコースにおけるウイルスゲノムの定量PCRによって決定できる。

結果

図1：HSV-1 DNAの標識アプローチ（A）流入ウイルスの状態を解析するため、G0期の静止期にあるMRC-5細胞に標識済みのHSV-1を感染させ、感染後4 hpi未満でゲノムを解析し、非複製ウイルスDNAを研究する。（B）複製ウイルスの状態を解析するため、MRC-5細胞に未標識のHSV-1を感染させ、ウイルスDNA複製の開始後（≥4 hpi）、感染細胞の増殖培地にEdC（オレンジ色の星）を添加して2〜4時間インキュベートする。（C）ウイルス複製フォークを解析するため、感染細胞をEdCで5〜20分間パルス標識する。その後、deoxyCを用いて複製フォークをチェイスすることができる。EdC標識DNAはオレンジ色で示されている。この図はDembowskiおよびDeLucaの文献から改変したものである

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
MRC-5細胞	ATCC	CCL-171
ウシ胎児血清 (FBS)	Gibco	26140-179
ダルコ modified Eagle 中量培地 (DMEM)	Gibco	12800-082	10% FBS、2 mM L-グルタミン、および12 mM（フラスコでの培養用）または30 mM（ディッシュでの培養用）重曹（炭酸水素ナトリウム）を添加。
60 cm2² 組織培養皿	Thermo Fisher Scientific	166508
トリス緩衝生理食塩水 (TBS)、pH 7.4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
HSV-1ストック			1x10⁹ PFU/mL以上のタイターのストックが最適である。
5'-エチニル-2'-デオキシシチジン (EdC)	Sigma-Aldrich	T51307	DMSOに溶解して40 mMのストック溶液を調製し、分注して-20 °Cで保存する。20 °C
細胞培養インキュベーター
バイオセーフティキャビネット
ヒートブロック			65 °C および 95 °C