ウイルスDNA-タンパク質複合体からのタンパク質の単離

要約

出典：Dembowski, J. A. 他。ウイルスに関連するウイルスおよび細胞タンパク質の同定のためのウイルスDNAの精製。J. Vis. Exp. (2017)。このビデオでは、クリック化学と磁気ビーズ精製を用いて、細胞核からタンパク質-ウイルスDNA複合体を単離する方法を実演します。プロトコルには、アルキン修飾ヌクレオチドによるウイルスゲノムの標識、クリック反応を介したビオチン化、およびストレプトアビジンコート磁気ビーズへの結合が含まれます。洗浄と加熱溶出の後、精製された複合体を回収し、急速冷凍して、下流解析のために保存します。 Dembowski, J. A., 他結合するウイルスおよび細胞タンパク質の同定のためのウイルスDNAの精製。 J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、クリック化学と磁気ビーズ精製を用いて、細胞核からタンパク質-ウイルスDNA複合体を単離する方法を実演します。本プロトコルでは、アルキン修飾ヌクレオチドによるウイルスゲノムの標識、クリック反応によるビオチン化、およびストレプトアビジンコート磁気ビーズへの結合を行います。洗浄および熱溶出後、精製された複合体を回収し、急冷凍結して、後続の解析のために保存します。

プロトコル

1. vDNAおよび関連タンパク質の精製

注記：すべての緩衝液および試薬は、使用前に氷上で冷却し、特に指示がない限り、すべての操作を氷上で行ってください。

1. 核を回収する。注記核を単離する前に、ホルムアルデヒドを用いてタンパク質をDNAに架橋させることができます。これにより、ストレプトアビジンコートビーズによるDNA精製時に、より厳格な洗浄条件を用いることが可能になります。
   1. 培地を20 mLの核抽出バッファー（NEB）に置換し、20分間、以下の温度でインキュベートする。 4 °C 時折揺らしながら。顕微鏡下で核が観察できるようになります。
   2. セルスクレイパーを用いてプレートから核を掻き集め、50 mLコニカルチューブに移す。2,500 x gで10分間遠心分離し、 4 °C 核をペレット化するため、上清を捨ててください。
      注意点トリパンブルー染色を用いて、細胞から核が分離できているかを確認できる。
   3. 10 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて核ペレットを穏やかに剥離させ、15 mLコニカルチューブに移し、2,50 x gで10分間遠心分離してペレット化する。 4 °CPBSを完全に除去してください。
      注記：核を凍結させることができ、この時点でプロトコルを一時中断することが可能です。凍結させる場合は、核ペレットを次の溶液で穏やかに再懸濁し、 500 µL 凍結緩衝液を加え、チューブをエタノール/ドライアイス浴でインキュベートする。凍結した核は-で保存する。80 °C使用前に、核を室温で解凍し、速やかに氷上へ移す。PBSを10 mL加え、緩やかに回転させて混合した後、2,500 x gで10分間遠心分離してペレットにする。 4 °C、そしてPBSを完全に除去します。核を凍結させると、回収率が低下する可能性があります。
2. ビオチンアジドを5-エチニル-2-デオキシウリジンに共有結合させる′-デオキシシチジン (EdC) 標識ウイルスDNAまたはvDNA。
   1. 核ペレットを10 mLのクリック反応ミックス（参照： 材料表10 mLピペットを用いて、ゆっくりと5回ピペッティングすることで混ぜ合わせます。
      注記クリック反応混合液に含まれる試薬は、指示された順序で添加することが重要です。
   2. 1時間、～で回転させる。 4 °C回転させながら、バッファーB1、B2、およびB3を調製し、冷却してください［参照 材料一覧].
   3. 2,500 x gで10分間遠心分離し、核をペレットにする。 4 °Cクリック反応混合液を完全に除き、10 mLのPBSで緩やかに再懸濁した後、2,50 x gで10分間遠心分離してペレットを洗浄します。 4 °C.
   4. 核ペレットを1 mLのPBSで穏やかに再懸濁し、大口径のピペットチップを用いて1.5 mLマイクロ遠心チューブに移す。2,50 x gで10分間遠心分離し、核をペレット化する。 4 °CPBSを完全に除き、液体窒素で急速凍結させる。
      注記：この時点でプロトコルを中断することができ、凍結した核は- で保存可能です。80 °C凍結融解を行うことでその後の溶菌が促進されるため、同日にステップ1.3に進む場合であっても、核を急冷凍結させることが推奨される。
3. 核を溶解し、DNAを断片化する。
   1. 核を氷上で解凍し、以下の溶液に再懸濁する。 500 µL ピペッティングによりBuffer B1を混合する。氷上で45分間インキュベートする。
   2. 3 mmのマイクロチッププローブを用い、振幅40%で、各30秒間の超音波処理を6回行う。パルスの間は、サンプルを30秒間氷上に置く。超音波処理後、サンプルは濁っておらず、透明であること。
      注意点ソニケーション条件は、個々のソニケーターに合わせて最適化する必要があります。
   3. 14,00 x gで10分間遠心分離し、細胞残渣を沈殿させる。 4 °Cペレットのサイズが大幅に減少しているはずです。上清を次を用いてろ過します。 100 µM セルストレーナーでろ過し、ろ液を回収する。
   4. 添加する 500 µL ろ過後の上清にバッファーB2を加えます。 900 µL このサンプルのうちの一部をステップ1.4.2で使用します。
   5. DNA分離用に、各条件から分注量を取り出す（50 µL または1/20量)を加え、 50 µL 2x ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)-重炭酸溶液［参照 材料一覧]。DNA単離プロトコルに進みます。
   6. 各条件から、インプットタンパク質用に分注量を取り出す（50 µL または1/20量)を加え、 50 µL 2倍濃度Laemmliサンプルバッファー、液体窒素で凍結し、-で保存。80 °C.
4. ビオチン化DNAをストレプトアビジンコートビーズに結合させる。
   1. Streptavidin T1磁気ビーズを、以下の手順で転移させて調製します。 300 µL ビーズのスラリーを1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注する。サンプル1つにつき1本のビーズチューブを用意する。1 mLのバッファーB2を用いてビーズを3回洗浄する。洗浄手順は、ボルテックスで再懸濁し、マグネットを用いてビーズを分離させ、洗浄バッファーを吸引して除去する。
      注記結合条件を最適化することで、収量を最大化し、バックグラウンドの結合を最小限に抑えることができます。実験的に、Streptavidin T1磁気ビーズは、アガロースビーズや他のストレプトアビジンビーズよりも結合能が有意に高く、かつStreptavidin C1ビーズよりもバックグラウンドの結合が少ないことが確認されました。図1A).
   2. 添加する 900 µL ステップ1.3.4.のサンプルを洗浄後のビーズに加え、一晩回転させてください。 4 °C.
      注記：サンプルを添加した後は、ビーズをボルテックスしないでください。
      注意点ラベルなしのネガティブコントロールにおいて、相当量のDNAまたはタンパク質が単離される場合は、バックグラウンドの結合を抑えるために、このステップを一晩から4時間に短縮することができます。
5. ビーズを洗浄し、ウイルスDNAおよび結合タンパク質を溶出する。
   注記以降のステップでは、フィルターチップの使用が推奨されます。
   1. サンプルを磁気マイクロ遠心チューブラックに配置し、上清を除去して1 mLのBuffer B2で緩やかに再懸濁し、次の方程式で回転させます。 4 °C 5分間。
   2. ステップ 1.5.1 を3回繰り返す。
   3. サンプルをマグネット式マイクロ遠心チューブラックに設置し、上清を除去した後、1 mLのバッファーB3で穏やかに再懸濁し、以下の条件で回転させる。 4 °C 5分間。
   4. 転移 100 µL 結合DNAの単離のため、ビーズ混合液（全量の1/10量）を新しいチューブに移す。このチューブをマグネットに固定し、上清を除去した後、ビーズを再懸濁させる。 100 µL 1x sodium dodecyl sulfateまたはSDS-bicarb溶液を用い、DNA単離プロトコルに進みます。
   5. 残量が入ったチューブを適用します。 900 µL ステップ1.5.3.のビーズ混合物を磁石にかけ、上清を除去し、ビーズを以下に再懸濁する。 50 µL タンパク質およびDNA-タンパク質複合体を溶出させるための2x Laemmliサンプルバッファー。
   6. サンプルを以下の温度で加熱し、沸騰させます。 95 °C 15分間静置し、ボルテックスした後、マイクロ遠心機で迅速に遠心分離し、マグネットを適用する。溶出液を新しいチューブに移し、急冷凍結させ、- で保存する。80 °C.
      注記：煮沸中にチューブが開かないよう、キャップロックを使用してください。
      注意：ここでプロトコルを中断し、サンプルを-で保存することが可能です。80 °C 数週間。
   7. 標準的な手順に従い、Coomassie Blue染色、ウェスタンブロッティング、または質量分析によってタンパク質サンプルを分析する。代表的な結果を以下に示す。 図 1 および 2.
      注記質量分析に十分なタンパク質収量が得られているかを確認するために、 7.5 µL 各サンプルの［一部］を、クマシーブルー染色による分析に用い、 7.5 µL 代表的なウイルスゲノム結合タンパク質（ICP4、ICP8、またはUL42）のウェスタンブロッティング用に使用する。インプットタンパク質レベルのコントロールとして、ステップ1.3.6.の溶解液と同量を並行して流す。残りのサンプル（35 µL) をその後、質量分析により解析する。

結果

図1：代表的なタンパク質精製の結果。 (A) 複数の異なる種類のストレプトアビジンコートビーズを用いて精製ステップを行った際の、タンパク質収量の比較。タンパク質収量を比較するためにEdC存在下 (+) で、またはバックグラウンド結合を比較するためにEdC非存在下 (-) で感染を行った。感染およびEdC標識は、以下のように実施した。, また、異なる種類のストレプトアビジンコートビーズを同量ずつ用いて、DNA-タンパク質複合体を精製した。上段：ストレプトアビジンコートアガロースビーズまたはStreptavidin M-280による精製後のタンパク質収量の比較。下段：Streptavidin M-270、M-280、Streptavidin C1、またはStreptavidin T1による精製後のタンパク質収量の比較。ウエスタンブロッティングは、ウイルスタンパク質ICP4に対する抗体を用いて行った。比較のため、第1レーンに精製ICP4を示す。下段のパネルにおいて、各レーンで同程度のICP4の強度を観察するには、より長い露光時間を要した。 "280" 上パネルに示すように。(BEdC標識時間に応じた代表的なタンパク質精製結果を示す。感染およびEdC標識を行い、Streptavidin T1ビーズを用いてDNA-タンパク質複合体を精製した。EdC標識を0、20、40、または60分間行い、クマシーブルー染色（上）およびウェスタンブロッティング（下）の結果を示す。ウェスタンブロッティングは、ICP4、UL42、またはGAPDHに特異的な抗体を用いて行った。溶出液サンプルはステップ1.5.5から、ライセートはステップ1.3.6から採取した。矢印はストレプトアビジンを、Lはタンパク質ラダーを示す。

図2：プロテオミクスデータの異なる提示例。 (A) 円グラフは、6 hpiで精製されたウイルスゲノムに結合していたタンパク質溶出液の質量分析により同定されたタンパク質をまとめたものである。数値は各機能カテゴリーで同定されたタンパク質数を示す。Tは同定されたタンパク質の総数を示す。色は以下のカテゴリーを示す：紫 － RNAプロセシング、赤 － 転写、緑 － クロマチンリモデリング、オレンジ － DNA複製、黄 － 核輸送、ティール － 細胞骨格、濃青 － HSV構造タンパク質、灰色 － その他/不明。(B) ベン図は、6、8、または12 hpiでウイルスゲノムに結合していると同定されたタンパク質の重複を示す。(C) STRINGマップは、5分間のEdCパルス後にウイルス複製フォークに濃縮されたタンパク質を示す。ラベルなしのネガティブコントロールと比較して5倍に濃縮されたヒトタンパク質が機能相互作用マップに表示されており、このマップは高信頼性の相互作用のみを表示するデータ設定でSTRINGを用いて作成された。相互作用のマッピングには遺伝子名が使用された。円は同じ生物学的プロセスで機能するタンパク質を示す。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
MRC-5細胞	ATCC	CCL-171
ウシ胎児血清 (FBS)	Gibco	26140-179
ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)	Gibco	12800-082	10% FBS、2 mM L-グルタミン、および12 mM（フラスコでの培養用）または30 mM（ディッシュでの培養用）重炭酸ナトリウムを添加
60 cm² 組織培養皿	Thermo Fisher Scientific	166508
Tris緩衝生理食塩水 (TBS), pH 7.4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine
HSV-1ストック			1x10以上のタイターを持つストック⁹ PFU/mLが最適である
Sephadex G-25 カラム（PD-10 脱塩カラム）	GE Healthcare	17085101
ジメチルスルホキシド（DMSO）	Fisher Scientific	D128-1
5´-エチニル-2´-デオキシシチジン (EdC)	Sigma-Aldrich	T51307	DMSOに溶解して40 mMのストック溶液を調製し、分注して-20℃で保存する。20 °C
2'-デオキシシチジン (deoxyC)	Sigma-Aldrich	D3897	水に溶解して40 mMのストック溶液を調製し、分注して-80℃で保存する。20 °C
核抽出バッファー (NEB)			新鮮な（20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 30 mM ショ糖, 0.5% Igepal)
セルスクレイパー	Bellco製ガラス器具	7731-22000	使用前にオートクレーブ滅菌すること
トリパンブルー溶液	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7.2 (10倍濃度)			1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 10 mM Na+₂HPO₄, 18 mM KH₂PO₄ （使用前に滅菌水で1倍に希釈すること）
硫酸銅(II)五水和物 (CuSO₄·5時間₂O)	Fisher Scientific	C489	10 mMストック溶液を調製し、以下に保存する 4 °C 最大1か月間
(+) L-アスコルビン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	A4034	10 mMのストック溶液を調製し、使用時まで氷上で保存する。
ビオチンアジド	Invitrogen	B10184	DMSOを用いて10 mMのストック溶液を調製し、分注して-20℃で保存する。20 °C 最長1年間
クリック反応ミックス			使用直前に、以下の順序で試薬を添加して調製してください（10 mLあたり：1x PBS 8.8 mL、10 mM CuSO4 20 μL）。₄, 25mL 10 mM ビオチンアジ化物, 1 mL 100 mM アスコルビン酸ナトリウム)
完全プロテアーゼ阻害剤カクテル	Roche	11697498001	1 mLの水に溶解して50倍のストック溶液を調製し、以下で保存できる。 4 °C 最大1週間保存するか、あるいはバッファー50 mLにピル1錠を直接加える。
凍結緩衝液			新鮮な（10%グリセロール7 mL、NEB、 200 μL 50倍プロテアーゼ阻害剤)
バッファーB1			新鮮な溶液（25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x プロテアーゼ阻害剤）を調製する
緩衝液B2			新鮮なバッファー（150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x プロテアーゼ阻害剤）を調製する
バッファーB3			新鮮な溶液（150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x プロテアーゼ阻害剤）を調製する
3 mmマイクロチッププローブを備えたVibra Cell超音波処理装置	Sonics	VCX 130
セルストレーナー	Falconチューブ	352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Life Technologies	65601
DynaMag-2 マグネット	Life Technologies	12321D
ミニチューブローテーター	Fisher Scientific	260750F
2x Laemmliサンプルバッファー			40 mgのSDS、2 mLの10%グリセロール、1.25 mLの1 M Tris (pH 6.8)、および10 mgのブロモフェノールブルーを、8 mLの水に混ぜ合わせる。以下に保存する。 4 °C 最大6ヶ月間保存してください。使用前に、1 M DTTを最終濃度20 mMになるように添加してください。
1.5 mLチューブ用キャップロック	Fisher Scientific	NC9679153
標準的なウェスタンブロッティング試薬
NOVEX Colloidal Blue 染色キット	Invitrogen	LC6025
12ウェル細胞培養プレート	Corning	3513
カバーガラス	Fisher Scientific	12-545-100	使用前にオートクレーブ滅菌すること
顕微鏡スライド	Fisher Scientific	12-552-5
16%パラホルムアルデヒド	Electron Microscopy Sciences	15710	使用前に1x PBSで3.7%に希釈する
ウシ血清アルブミン (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	1x PBSを用いて3%溶液を調製する
透過処理バッファー（0.5% Triton-X 10）	Sigma-Aldrich	T8787	1x PBSを用いて0.5% Triton-X 10溶液を調製する。
クリック反応カクテル - Click-iT EdU Alexa Fluor 48 Imaging Kit	Molecular Probes	C1037	メーカーのプロトコルに従って調製する
2x SDS-重曹溶液			2% SDS, 20 mM NaHCO3₃
10x Tris EDTA (TE)緩衝液, pH 8.0			10 mM Tris, 10 mM EDTA（使用前に1倍に希釈すること）
1.5 mLチューブ用マイクロ遠心機
15 mLおよび50 mLチューブ用卓上遠心機
細胞培養インキュベーター
生物安全キャビネット
ヒートブロック			65 °C および 95 °C