塩化セシウムを用いたゲノム含有アデノウイルスベクターの精製

要約

出典： Ehrke-Schulz, E., 他ヒトアデノウイルス5型に基づいたハイキャパシティ・アデノウイルスベクターのクローニングおよび大規模生産。 J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、塩化セシウム密度勾配超遠心分離法を用いたハイキャパシティアデノウイルスベクターの精製について解説します。これにより、遺伝子導入、ベクターの特性解析、および前臨床治療研究への応用に不可欠な、ゲノム含有ビリオンの分離が可能になります。

プロトコル

1. HCAdV（高キャパシティアデノウイルスベクター）の精製および透析
   1. 塩化セシウム（CsCl）密度勾配用のウイルス溶菌液を調製するため、細胞-ウイルス懸濁液を液体窒素で凍結させ、37 °Cの水槽で4回凍結融解を行う。
   2. ウイルス溶菌液をRT（室温）で50 x g、8分間遠心分離し、HCAdV（高キャパシティアデノウイルスベクター）を含む上清を回収する。
   3. 超遠心分離用に、以下のようにCsCl溶液を調製する。CsCl粉末をそれぞれ37.5 g（1.5 g/cm³用）、3.5 g（1.35 g/cm³用）、31.25 g（1.25 g/cm³用）量り取り、dH₂Oで25 mlにする。
      1. 溶液が透明になるまで撹拌し、溶液を滅菌フィルターでろ過する。最後に、各溶液から1 mlを取り出して精密天秤で量り、密度が正しいか確認する。1 mlの重量はそれぞれ1.5 g、1.35 g、1.25 gである必要がある。
      2. 密度が高すぎる場合は、滅菌dH₂Oを少量（µl）ずつ段階的に添加して調整する。dH₂O添加後、再度密度を測定する。必要に応じて、さらにdH₂Oを添加する。
      3. 密度が正しくなるまでこの手順を繰り返す。密度が低すぎる場合は、少量のCsCl粉末を加えて調整する。再度滅菌フィルターでろ過し、密度を確認する。密度が高すぎる場合は、前述のようにdH₂Oを加えて調整する。依然として密度が低すぎる場合は、さらにCsClを加え、再度滅菌フィルターでろ過して密度を確認する。密度が正しくなるまでこの手順を繰り返す。
   4. 6本の透明な超遠心管にCsClステップ勾配を調製する。以下の順序で、CsCl溶液を慎重にゆっくりとチューブにピペッティングする：1.5 g/cm³ CsCl溶液を0.5 ml、1.35 g/cm³ CsCl溶液を3 ml、1.25 g/cm³ CsCl溶液を3.5 ml（図1C）。
   5. 手順1.2で得られた清澄化したベクター上清を約4.5 ml、1.25 g/cm³ CsCl層の上に重ねる。スイングローター（SW-41）を備えた超遠心機を用い、12 °Cで、緩やかな加速および減速設定にて、少なくとも2時間、26,0 x g（35,0 rpm）で勾配遠心を行い、HCAdVゲノムを含むウイルス粒子を空粒子および細胞残渣から分離させる。
      注：最適条件下では、チューブの上部に細胞残渣の拡散帯が形成される。その下に2本の白いバンドが観察される。上側のバンドには空粒子が含まれ、下側のバンドがHCAdVに相当する（図1Cおよび2A）。
   6. 細胞残渣の層と空粒子の層を慎重に取り除き、各チューブの下側バンドから1 mlを回収し、清潔なピペットチップを用いて滅菌50 mlチューブにウイルスを移す。回収したウイルス粒子に1.35 g/cm³ CsCl溶液を最大24 mlまで加え、慎重に混合する。
   7. 遠心管に1.35 g/cm³ CsCl-ウイルス溶液を満たし、スイングローター（SW-41）を備えた超遠心機を用い、緩やかな加速および減速設定にて、12 °CでO/N（オーバーナイト）（18-20時間）、26,0 x g（35,0 rpm）で遠心分離する。
   8. 顕著な下側バンドに存在するHCAdVを回収する。上側のバンドに空粒子が含まれている可能性があるため、ピペットを用いて上層を取り除く（図1Cおよび2B参照）。その後、ピペットを用いて下側バンドを回収する。
   9. バッファー交換のため、回収したウイルス粒子を透析する。
      1. 透析チューブ（MWCO: 50,00）を長さ約8 cmに切り、滅菌dH₂Oで3回洗浄する。次に、透析チューブの片端をプラスチッククランプで閉じ、1 mlピペットを用いて手順5.8で回収したウイルスをチューブ内に移す。チューブ内に気泡が入らないように注意し、もう一方の端をプラスチッククランプの透析封止具で閉じる。
      2. 1 Lの透析バッファー（10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10% glycerol、および脱イオンH₂O中の1 mM MgCl₂ (塩化マグネシウム)）を用い、4 °Cで緩やかに撹拌しながら2時間透析する。透析バッファーを2 Lの新しいものと交換し、4 °Cで緩やかに撹拌しながらO/Nで透析する。あるいは、スクロースバッファー（140 mM NaCl (塩化ナトリウム)、5 mM Na₂HPO₄.2H₂O (リン酸水素二ナトリウム)、1.5 mM KH₂PO₄ (リン酸二水素カリウム)、および730 mM sucrose, pH 7.8）を使用してもよい。
      3. 手順1.9.2で透析したウイルス粒子を1 mlピペットで回収する。必要に応じた小容量（25-10 µl）に分注し、精製ウイルスを-80 °Cで保存する。

結果

図1. pAdVFTCからのHCAdV（高容量アデノウイルスベクター）ゲノムのクローニング手順および放出の代表的な結果。(A) PI-SceIおよびI-CeuI消化によるpHM5からの目的遺伝子（GOI）発現カセットの放出。(B) 精製したGOI発現カセット、およびPI-SceIとI-CeuIで消化し精製および脱リン酸化したpAdVFTC。(C) GOIを含む、または含まないpAdVFTCクローンの分析用HincII消化。(D) NotI消化によるpAdVFTC-GOIからのGOI搭載HCAdVゲノムの放出

図2. 塩化セシウム (CsCl) 密度勾配遠心分離後の代表的な結果。 (A) ステップ勾配実施後（ステップ1.5も参照）； (B) 連続勾配実施後（ステップ1.7も参照）。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Ultra Clear 超遠心管	Beckman Coulter	344059	密度勾配遠心分離
超遠心機	Beckmann Coulter		密度勾配遠心分離
SW-41ローター	Beckmann Coulter		密度勾配遠心分離
Spectrum Laboratories社 Spectraporメンブレン	VWR	132129	透析チューブ
即用ダイアリシスカセット	Thermo	66383	透析
塩化セシウム	Carl Roth	8627.1	密度勾配遠心分離
LB培地	Carl Roth	X968.3	細菌増殖培地
Tris-HCl 9%	Carl Roth	9090.3	透析バッファー／溶解バッファー
グリセロール 9.5%	Carl Roth	3783.1	透析緩衝液
MgCl₂₂ 98.5%	Carl Roth	KK36.2	透析バッファー
NaCl	Carl Roth	3957.1	任意透析バッファー
KH₂PO₄	Carl Roth	3904.2	任意の透析緩衝液
ショ糖	Carl Roth	9286.1	任意の透析バッファー
Na₂高浸透圧₄·2時間₂O	Carl Roth	4984.2	任意透析バッファー
1.5 mlチューブ	sarstedt	72,730,005	ウイルス調製物の-での保存80 °C