齧歯類心室組織におけるウイルス導入遺伝子の発現 注：標的遺伝子を発現する組換えアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（AAV）、およびそれに対応するコントロールウイルス（Ad-GFP（緑色蛍光タンパク質）（力価 1 x 10^10 plaque-forming units [PFU]/mL）またはAAV9-GFP（力価 1 x 10^13 genome copies [GC]/mL）など（材料表を参照））は、-80 °Cのフリーザーで保存すること。 ウイルス注射当日、ウイルスを氷上で解凍する。標的遺伝子を発現するウイルスとコントロールウイルスを、それぞれ別のシリンジ（容量 50 µL、30 G 1/2針）に吸引し、使用するまで氷上で保持する。 注：シリンジおよび針の中にある気泡は、注意深く除去しなければならない。 ラットまたはマウスにブプレノルフィンを投与し（ラット 0.05 mg/kg、マウス 0.1 mg/kg、皮下投与）、1時間後に3%イソフルランを用いて麻酔を導入し、その後の処置の間、イソフルランを2%（100%酸素、流量 0.5-1.0 L/min）で維持する。 ピンセットで動物の体（尾など）を軽くつまみ、つまみ刺激に対して身体的な反応が見られないことを確認して、適切な麻酔状態であることを確認する。 電気加熱パッドを用いて体温を37 °Cに維持する。バリカンを用いて胸部の被毛を剃る。 注：電気加熱パッドは熱分布が不均一になる可能性があるため、使用時に注意すること。 角膜の乾燥を防ぐため、両眼に眼軟膏を塗布する。 動物を仰臥位にし、前臨床イメージングシステム（材料表を参照）を用いて、動物の心臓を短軸方向で超音波イメージングする。 注：以下の手順は、無菌環境を提供するバイオセーフティレベルIIキャビネット内で行う。安全な針の取り扱いを含む、標準的な安全手順を適用する。 ヨード系またはクロルヘキシジン系のスクラブ剤とアルコールを交互に使い、円を描くように3回、動物の左下胸部を滅菌する。 超音波イメージングによるガイド下で、手順1.1で準備したウイルスを含むシリンジの30 G 1/2針を、体の左下胸側から動物の胸腔内に挿入する。 針先を左心室前壁の自由壁に近づけ、ウイルスを10-15 μLゆっくりと注入する。超音波画像において、針先の付近で輝度が高まったことを確認し、注入の成功を検証する。 注：心筋組織への物理的損傷を防ぐため、各部位へのウイルス注入量は15 μLを超えないようにする。 心臓から針を抜き、左心室の別の領域に挿入して、同量のウイルスを2回目および3回目の注入として投与する。 注：総注入部位数は実験デザインによって決定する。局所的な導入遺伝子の発現が必要な場合は1回の注入のみで十分であり、より拡散した導入遺伝子の発現が必要な場合は、通常、複数の注入部位（3〜5箇所）が必要となる。 注入完了後、動物をケージに戻す。 動物が胸立位を維持できる程度に十分な意識を回復するまで注意深く観察し、飼育室に戻す。 その後2日間、動物に塩酸ブプレノルフィンを投与する（マウス 0.1 mg/kg 1日2回、ラット 0.05 mg/kg 1日2回、皮下投与）。動物を動物飼育施設に戻し、痛みや苦痛の異常な兆候がないか毎日観察し、認められた場合は施設動物ケア委員会のプロトコルに従って処置する。 Lu, A., 他 げっ歯類心臓におけるウイルス外来遺伝子発現および心不整脈リスクの評価 J. Vis. Exp. (2022)
このビデオでは、マウスモデルにおける超音波ガイド下心筋内注入による組み換えウイルスベクターの導入方法を解説します。この手法により、心臓への標的遺伝子導入が可能となり、導入遺伝子の発現が心機能に及ぼす影響を研究することができます。
