1. 再細胞化ラット肝臓への導入 アデノ随伴ウイルス由来ウイルスベクター（AAVベクター）の大規模製造 AAVベクターの製造、精製、および定量： 簡潔に述べると、ローラーボトルでAAVベクターを製造し、ヨジキサノール密度勾配遠心法により精製する。PD10ゲルろ過カラムによるろ過で残留ヨジキサノールを除去する。ゲノムAAV DNAを標準物質として用い、定量PCR（qPCR）によりAAVベクター濃度を決定する。 注：本研究で使用した自己相補的擬似型AAV2/6ベクターは、導入効率を実証するためのリポーターとしてエメラルドグリーン蛍光リポータータンパク質（EmGFP）、および内因性発現遺伝子（ヒトシクロフィリンB (hCycB)、図1）をノックダウンするためのショートヘアピンRNA（shRNA）発現カセットをコードしている。セロタイプ6の擬似型scAAVベクターを十分な量（肝臓モデル1つあたり2.7 x 1013 AAVベクター）確保すること。 肝臓モデルへの導入 リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を適量加え、AAVベクター溶液を最終濃度5 mL中に2.7 x 1013ベクターゲノムとなるように調整する。 カニューレからチューブを取り外し、肝臓を培地回路から切り離す。門脈のカニューレに5 mLシリンジを接続し、AAVベクター溶液全量（5 mL）を注入する。 注：任意でフェノールレッド（5 µg/ml）を添加し、肝臓全体へのAAVベクター溶液の分布を確認することができる。 ポンプを作動させずに1時間インキュベートする。流速を段階的に上げ、まず1.25 ml/minで10分間、次に2.5 ml/minで20分間、そして3.75 ml/minで30分間とする。再細胞化したラット肝臓を6日間培養する。 2. 導入後の再細胞化ラット肝臓の評価 ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色および免疫組織化学的解析 メスを用いて、各肝葉からサンプル（0.5 x 0.5 x 1.5-2 cm）を採取する。 サンプルを4%パラホルムアルデヒド（PFA）＋4%スクロース溶液に入れ、4 °Cで1.5時間インキュベートする。（注意：PFAは毒性および発がん性がある。常にドラフトチャンバー内で取り扱い、適切な保護衣を着用すること。）PBSで3回洗浄し（1回あたり1分）、8%スクロース中で4 °Cにて一晩インキュベートする。 プラスチック製クライオモールドに固定剤を注ぎ、気泡が入らないようにサンプルを固定剤の中に入れる。サンプルが十分に覆われるまで固定剤を追加する。包埋したサンプルは、使用時まで-80 °Cで保存する。 クライオトームを用いて凍結切片（10 µm）を作成する。ヘマトキシリン・エオジン染色により再細胞化を評価する。目的遺伝子（ここではEmGFP）の免疫組織化学的染色により導入効率を評価する。 Hiller, T. 他 ヒト肝細胞癌細胞株HepG2で再構成した三次元肝臓モデルにおけるウイルスベクトルの研究 J. Vis. Exp. (2016)
このビデオでは、再細胞化したラット肝臓モデルにおけるウイルス遺伝子導入を評価するための免疫組織化学染色の手順を説明します。抗体検出および核染色との共局在によって確認されるレポーターの発現は、細胞へのウイルス導入が成功したことを示しています。
