安定導入細胞株の作製 12ウェルプレートを用い、10%胎児牛血清（FBS）および1%ペニシリン/ストレプトマイシン（Pen/Strep）を添加したDulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）中で、HCT16大腸がん細胞およびMDA-MB-231乳がん細胞を50,0細胞/ウェルで播種する。細胞が60～70%コンフルエントになるまで、37 °C、5% CO2条件下でインキュベートする。 細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、ウイルス含有培地1 mLをがん細胞に添加して、37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートする。コントロールとして、10% FBSおよび1% Pen/Strepを添加した新鮮なDMEM培地1 mLを、がん細胞の入った2ウェルに添加する。 ウイルス含有培地を吸引により慎重に除去する。細胞をPBSで洗浄し、培地を10% (v/v) テトラサイクリンフリー（Tet-free）FBSおよび1% Pen/Strep含有DMEMに変更する。 72時間後、細胞をPBSで洗浄し、ウイルス導入細胞を選択するため、培地を10% Tet-free FBS、1% Pen/Strep、および1 µg/mLピューロマイシン含有DMEMに変更する。 使用する細胞株に応じて、非導入細胞を用いてピューロマイシンの濃度範囲（0.1、0.5、1、2、および5 µg/mL）をテストし、3日間の培養後にコントロール細胞が生存しない最低濃度を選択することで、最適な選択のためのピューロマイシン濃度を調整する。 ピューロマイシンの存在下で3～14日間培養し、ウイルス導入細胞を選択する。コントロールとして、非導入細胞を入れた2つのウェル（一方はピューロマイシン含有培地、もう一方はピューロマイシンなしの培地）を別途用意する。コントロールウェルと比較して、ウイルス導入細胞のウェルでは、ピューロマイシンによって細胞が部分的に死滅することを確認する。 注：非導入細胞はピューロマイシンの存在下では増殖しない。 ピューロマイシン耐性のHCT116大腸がん細胞およびMDA-MB-231乳がん細胞において、条件付きノックダウン（KD）の効率を検証する。 注：ドキシサイクリンの有効濃度は使用する細胞株によって異なるため、タイトレーションが必要である（通常は10 ng/mLから2 µg/mLの範囲）。 細胞にとって毒性がなく、かつ目的タンパク質の発現をダウンレギュレートするのに有効なドキシサイクリン濃度を決定する。本プロトコルでは、in vitroで1 µg/mLが有効であった。 0.1、1、および2 µg/mLのドキシサイクリンの存在下および不在下で、細胞を72時間培養する。ウェスタンブロット分析により、細胞溶解液中のダウンレギュレートされたタンパク質（ここではプラスミノゲン活性化抑制因子1（PAI-1））の発現レベルを検証する。ショートヘアピンRNA（shRNA）を条件付きで発現させているHCT16細胞およびMDA-MB-231細胞を、スクランブルコントロール細胞と比較する。 Kubala, M. H. & DeClerck, Y. A. 腫瘍微小環境への単球/マクロファージの動員を研究するための、がん細胞株における遺伝子発現の条件付きノックダウン。 J. Vis. Exp. (2017)
このビデオでは、Tet誘導性レンチウイルスshRNAシステムを用いた条件付きノックダウンがん細胞株の作製方法を解説します。ウイルス導入、抗生物質による選択、およびドキシサイクリン誘導性遺伝子サイレンシングの手順について説明します。
