超遠心法によるウイルス粒子の濃縮 注：本手法では、ショ糖密度勾配ステップとショ糖クッションステップの2段階からなる二重ショ糖精製法を用いる（図1）。 ショ糖密度勾配を作成するため、円錐型超遠心チューブに以下の順で溶液を入れる：0.5 mLの70%ショ糖（1xリン酸緩衝生理食塩水 [PBS]に溶解）、0.5 mLの60%ショ糖（DMEMに溶解）、1 mLの30%ショ糖（Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM]に溶解）、および2 mLの20%ショ糖（1x PBSに溶解）。 ウイルス含有上清を勾配層の上に慎重に加える。15 cmプレート4枚分の上清の総量は100 mLであるため、ウイルス上清の全量を処理するには、1回の遠心につき6本の超遠心チューブを使用する。 このステップで使用する各超遠心チューブの最大容量は30 mL（ショ糖の容量を含む）である。ウイルス上清を各チューブに均等に分配し、液漏れを防ぐため、少なくとも10%のヘッドスペースを確保する。 実験に15 cmプレートを4枚より多く使用する場合は、プールしたウイルス上清の最終量が6本の超遠心チューブに容易に収まるよう、プレートあたりの培養液量を約20～22 mLに調整する。 超遠心チューブには、全容量の少なくとも4分の3まで充填すること。そうしないと、遠心中にチューブが破損し、サンプルの損失や装置の損傷を招く可能性がある。 1x PBSでチューブの重量バランスを調整し、17 °C、70,000 x gで2時間遠心分離する。 注：加速時にショ糖層が乱れるのを防ぐため、超遠心機の加速設定を、開始後3分間でローターが200 rpmに達するよう緩やかに設定する。同様に、遠心終了時の減速設定も、3分かけて200 rpmから0 rpmまで緩やかに減速するように設定する。 30～60%ショ糖分画を慎重に回収し、清潔なチューブに移す（図1）。プールした分画に冷たい1x PBSを加え、全量を100 mLにする。ピペッティングを数回繰り返し、混合する。 ウイルス調製液をショ糖クッションの上に慎重に重ねることで、ショ糖クッションステップへ進む。そのためには、チューブに4 mLの20%ショ糖（1x PBS中）を加え、続いて1本あたり約20～25 mLのウイルス溶液を加える。チューブの充填量が4分の3に満たない場合は、滅菌済み1x PBSで補充する。 前と同様に、慎重にバランスを調整し、17 °C、70,000 x gで2時間遠心分離する。上清を捨て、チューブをペーパータオルに逆さまにして残った液体を切り出す。 ペレットからすべての液体を取り除くため、残った液滴を吸引する。この段階で、ウイルス含有ペレットは小さな半透明の点としてかろうじて視認できるはずである。 最初のチューブに70 µLの1x PBSを加えてペレットを再懸濁し、ピペッティングで十分に混和させる。その後、その懸濁液を次のチューブに移して同様に混合し、すべてのペレットが再懸濁されるまでこれを繰り返す。 さらに50 µLの冷たい1x PBSでチューブを洗浄し、同様に混合する。最終的な懸濁液の合計量が約120 µLであり、わずかに乳白色に見えることを確認する。卓上マイクロ遠心機を用い、10,000 x gで30秒間遠心して清澄化する。 上清を新しいマイクロ遠心チューブに移し、10 µLずつ分注して-80 °Cで保存する。 注：レンチウイルスサンプルへの繰り返しの凍結融解を避けること。遠心分離が必要な場合を除き、残りのステップは適切なバイオセーフティ対策を講じた上で、組織培養用フード内または指定の組織培養室で実施するように努めること。 Vijayraghavan, S. および Kantor, B. 分裂細胞におけるCRISPR/Cas9介在性遺伝子ノックアウトのためのインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター作製プロトコル。 J. Vis. Exp., (2017)
このビデオでは、ショ糖密度勾配とショ糖クッションを用いた2段階の超遠心分離法により、細胞培養上清からウイルス粒子を精製し、濃縮する方法を実演します。この手順により、浮遊密度に基づいた分離が可能となり、後続のアプリケーションに適した、完全な状態で保持されたウイルスの回収が可能になります。
