ウイルス価の推定p24（ヒト免疫不全ウイルス（HIV）-1 p24カプシドタンパク質）-酵素結合免疫吸着法（ELISA） 注：本アッセイは、NIH AIDS Vaccine ProgramのHIV-1 p24抗原キャプチャーアッセイキット（材料表を参照）の指示に従い、一部変更を加えて高結合96ウェルプレートを使用して実施する。 翌日、冷PBS中の0.05% Tween 20（PBS-T溶液）200 µLでウェルを3回洗浄する。1x PBSで1:1500に希釈したモノクローナル抗p24抗体100 µLをプレートにコートし、4 °Cで一晩インキュベートする。 非特異的結合を排除するため、PBS中の1% BSA 200 µLでプレートをブロッキングし、冷PBS中の0.05% Tween 20（PBS-T溶液）200 µLで室温で少なくとも1時間、3回洗浄する。 検体を調製する：濃縮ベクトル調製液の場合、検体1 µLにdd-H2O 89 µLとTriton X-100 10 µL（最終濃度10%）を加えて100倍に希釈する。非濃縮調製液の場合、10倍希釈検体を調製する（検体10 µLにdd-H2O 80 µLとTriton X-100 10 µL（最終濃度10%）を加える）。 注：この段階で検体を-20 °Cで長期間保存し、後で使用することができる。 開始濃度5 ng/mLとして2倍連続希釈を行い、HIV-1標準液を調製する。 濃縮検体（1:100予備希釈ストックから）を、0.2% Tween 20および1% BSAを添加したRPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute 1640培地）で希釈し、1:10,000、1:50,000、および1:250,000の希釈系列を作成する。非濃縮検体（1:10予備希釈ストックから）を、0.2% Tween 20および1% BSAを添加したRPMI 1640で希釈し、1:500、1:2,500、および1:12,500の希釈系列を作成する。 検体をプレートに3連で分注し、4 °Cで一晩インキュベートする。 翌日、ウェルを6回洗浄し、RPMI 1640、10% FBS、0.25% BSA、および2%正常マウス血清（NMS）で1:1000に希釈したポリクローナルウサギ抗p24抗体100 µLを用いて、37 °Cで4時間インキュベートする。 上記と同様に6回洗浄し、5%正常ヤギ血清、2% NMS、0.25% BSA、および0.01% Tween 20を添加したRPMI 1640で1:10,000に希釈したヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼIgGを用いて、37 °Cで1時間インキュベートする。 上記と同様にプレートを洗浄し、TMB（3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン）ペルオキシダーゼ基質を用いて室温で15分間インキュベートする。 1 N HCl 100 µLを加えて反応を停止させる。吸光プレートリーダーを用いて、450 nmで検体の吸光度を測定する。 Vijayraghavan, S., 他 分裂細胞におけるCRISPR/Cas9介在性遺伝子ノックアウト用インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター作製プロトコル J. Vis. Exp. (2017).
このビデオでは、p24 ELISAを用いてレンチウイルスベクターのウイルスタイターを推定する方法を実演します。このアッセイでは、ウイルス粒子を溶解させてp24を放出させ、特異的抗体で捕捉し、測定可能な色の変化を生じさせるペルオキシダーゼ結合システムで検出します。サンプルの吸光度値を標準曲線と比較することで、ウイルスタイターを定量します。
