プラスミドトランスフェクションによる組換えアデノ随伴ウイルスの作製

要約

1. 組換えアデノ随伴ウイルス9（rAAV9）プラスミドを用いたHEK293細胞へのトランスフェクション 1.1 1 µg/µlの線状ポリエチレンイミン（PEI）溶液を調製する。PEI粉末を70～80 °Cに加熱したエンドトキシンフリーのdH2Oに溶解させる。室温まで冷却後、1 M HClを用いて溶液をpH 7.0に中和する。溶液をフィルター滅菌（0.2 µm）する。1 µg/µlのPEIストック溶液を分注し（1,40 µl/チューブ）、-20 °Cで保存する。 1.2 10%胎児ウシ血清（FBS）および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）でHEK293細胞を培養する。細胞は、37 °C、5 ± 0.5%二酸化炭素（CO2）インキュベーター内で培養する。 1.3 0日目に、トランスフェクションの18～20時間前に、90%以上のコンフルエントに達した細胞を1:2に希釈して10枚の150 mmディッシュに播種する。 注：1日目に細胞が90%コンフルエントに達している必要がある。 1.4 1日目に、PEIを用いて、rAAV9プラスミド（例：rAAV9.cTNT::GFPまたはrAAV6.U6::shRNAコンストラクト）、Ad-Helperプラスミド、およびAAV-Rep/CapプラスミドをHEK293細胞にトランスフェクションする。 1.4.1 90%コンフルエントの細胞10枚分として、AAV-Rep/Capプラスミド70 µg、rAAV9プラスミド70 µg、およびAd-Helperプラスミド20 µgを50 ml遠心チューブに混ぜ合わせる。 1.4.2 細胞のコンフルエント率が低い場合は、DNA量を比例して調整する。例えば、コンフルエント率が75%の場合、DNA量を比例して減らす（ステップ1.4.1に示した量の75/90倍とする）。具体的には、AAV-Rep/Capプラスミド 70 x 75/90 = 58.3 µg、rAAV9プラスミド 70 x 75/90 = 58.3 µg、およびAd-Helperプラスミド 20 x 75/90 = 16.7 µgを50 ml遠心チューブに混ぜ合わせる。 1.4.3 50 mlチューブに室温のDMEM（FBSなし）49 mlを加え、十分に混ぜ合わせる。 1.4.4 PEI:DNA比（v/w）が4:1となるように、PEI溶液1,360 µlを加える。十分に混ぜ合わせ、室温で15～30分間インキュベートする。 1.4.5 ステップ1.4.4で調製した混合液5 mlを各150 mmディッシュに加える（150 mmディッシュ10枚分で混合液50 ml）。 1.4.6 37 °C、5 ± 0.5% CO2インキュベーター内で60～72時間、細胞を培養する。 Ding, J., 他マウス心臓における遺伝子の過剰発現またはノックダウンのためのrAAV9の調製。 J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、哺乳類細胞へのプラスミド導入による組換えアデノ随伴ウイルス粒子の作製について解説します。核内でのウイルスゲノムの複製およびカプシドの構築を促進するRep、Cap、およびヘルパータンパク質の協調的な発現について重点的に説明します。

プロトコル

1. 組換えアデノ随伴ウイルス9（rAAV9）プラスミドを用いたHEK293細胞へのトランスフェクション

1. 準備 1 µg/µl 線状ポリエチレンイミン（PEI）溶液。PEI粉末をエンドトキシンフリーの超純水（dH2O）に溶解させる。₂70-80 °C室温まで冷却した後、1 M HClを用いて溶液をpH 7.0に中和する。フィルター滅菌（0.22 µm溶液をろ過滅菌（0.22 µm）する。1 µg/µl PEIストック溶液を分注し、 1 µg/µl PEIストック溶液（1,400 µl/tube）し、溶液を-20 °C.
2. HEK293細胞を、10%胎児牛血清（FBS）および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）で培養する。細胞を、以下の条件のインキュベーターで培養する。 37 °C 5%のCO2を備えたインキュベーター ± 0.5% 二酸化炭素 (CO2)₂).
3. 0日目に、トランスフェクションの18～20時間前に、HEK293細胞を10枚の150mmディッシュに播種する。その際、細胞を分割して播種すること。 > 90%以上のコンフルエントに達した細胞を1:2に希釈して播種する。
   注： 1日目に、細胞が90%のコンフルエンスに達している必要があります。
4. 1日目に、PEIを用いて、rAAV9プラスミド（例：rAAV9.cTNT::GFPまたはrAAV6.U6::shRNAコンストラクト）、Ad-Helperプラスミド、およびAAV-Rep/CapプラスミドをHEK293細胞にトランスフェクションする。
   1. コンフルエンスが90%の細胞10皿分に対し、以下を混合する。 70 µg AAV-Rep/Capプラスミドの 70 µg rAAV9プラスミド、および 200 µg 50 ml遠心チューブにAd-Helperプラスミドを入れ、
   2. 細胞のコンフルエンスが低い場合は、DNA量を比例して調整してください。例えば、細胞のコンフルエンスが75%の場合、DNA量を比例して減らします（ステップ1.4.1に記載された量の75/90倍）。具体的には、70 x 75/90 = 58.3 µg AAV-Rep/Capプラスミド、70 x 75/90 = 58.3 µg rAAV9プラスミド、および 20 x 75/90 = 166.7 µg 50 ml遠心チューブにAd-Helperプラスミドを（加えて混合する）。
   3. 50 ml遠心チューブに室温のDMEM（FBS不含）を49 ml加え、よく混ぜ合わせる。
   4. 添加する 1,360 µl PEI溶液を加え、PEI:DNA比（v/w）を4:1にする。よく混合し、室温で15〜30分間インキュベートする。
   5. ステップ1.4.4で調製した混合液を、150mmディッシュ1枚につき5mlずつ加える（10枚の150mmディッシュで計50mlの混合液を使用）。
5. 細胞を、以下の条件下で培養する。 37 °C 5%の二酸化炭素（CO2）を備えたインキュベーター ±0.5% CO2₂ 60～72時間。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ポリエチレンイミン、リニア (MW 25,0)	Polysciences, Inc.	#2396-2
ポリプロピレンチューブ、36.2 ml, 25 x 87 mm, (56本入り)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
DMEM培地	Fisher Scientific	SH30243FS
ウシ胎児血清 (FBS)	Atlanta Biologicals	S1150
rAAV9ベクター	Penn Vector Core	P1967