導入済みヒト腎細胞からのリコンビナントウイルス粒子の精製

出典： Ding, J. 他、マウス心臓における遺伝子の過剰発現またはノックダウンのためのrAAV9の調製 J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、形質転換したヒト腎細胞から組換えウイルス粒子を精製する方法を示します。ウイルスは凍結融解破砕によって放出され、ブロック共重合体補助ろ過を伴うヨジキサノール密度勾配を用いて精製されます。

組換えアデノ随伴ウイルス9（rAAV9）プラスミドを用いたHEK293細胞へのトランスフェクション
1. 準備 1 µg/µl 線状ポリエチレンイミン（PEI）溶液。PEI粉末をエンドトキシンフリーの蒸留水（dH2O）に溶解させる。₂70℃まで加熱したO80 °C室温（RT）まで冷却した後、1 M 塩酸（HCl）を用いて溶液を pH 7.0 に中和します。フィルター滅菌し、0.22 µm) 溶液。～を分注する。 1 µg/µl PEIストック溶液（1,400 µl/tube)とし、溶液を-で保存する。20 °C.
2. HEK293細胞を、10%胎児牛血清（FBS）および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDulbecco改良イーグル培地（DMEM）で培養する。細胞を以下で培養する。 37 °C 5% CO2インキュベーター ± 0.5% 二酸化炭素 (CO₂).
3. 0日目に、分注によりHEK293細胞を150 mmディッシュ10枚に播種し、トランスフェクションの18～20時間前に準備する。 > 1:2希釈液における90%コンフルエントの細胞。
  注意： 1日目には、細胞のコンフルエンスが90%に達している必要があります。
4. 1日目に、PEIを用いて、rAAV9プラスミド（例：rAAV9.cTNT::GFPまたはrAAV6.U6::shRNAコンストラクト）、Ad-Helperプラスミド、およびAAV-Rep/CapプラスミドをHEK293細胞にトランスフェクションする。
  1. コンフルエンスが90%に達した細胞10皿分に対し、以下を混合する。 70 µg AAV-Rep/Capプラスミドの 70 µg pfrAAV9プラスミド、および 200 µg 50 ml遠心チューブ内でのAd-helperプラスミドの
  2. 細胞のコンフルエンスが低い場合は、DNA量を比例して調整してください。例えば、細胞のコンフルエンスが75%である場合は、DNA量を比例して減らします（ステップ2.4.1に記載された量の75/90倍）。次のように混合します：70 x 75/90 = 58.3 µg AAV-Rep/Capプラスミドの、70 x 75/90 = 58.3 µg rAAV9プラスミドの、および200 x 75/90 = 166.7 µg 50 mL遠心チューブ内へのAd-Helperプラスミドの（導入/添加）
  3. 50mlチューブに室温のDMEM（FBS不含）を49ml加え、十分に混ぜ合わせる。
  4. 添加する 1,360 µl PEI溶液を加え、PEI:DNA比（v/w）を4:1にする。十分に混合し、室温で15～30分間インキュベートする。
  5. ステップ1.4.4で調製した混合液を、各150mmディッシュに5mlずつ加える（150mmディッシュ10枚分で計50ml）。
5. 細胞を以下の条件で培養します。 37 °C 5% $\text{CO}_2$ インキュベーター ±0.5% CO₂ 60～72時間。
形質導入したHEK293細胞の回収およびrAAV9ベクターの精製
1. トランスフェクションの60～72時間後に細胞を回収する。培養液を用いてピペッティングし、ディッシュ内の細胞を剥離させ、懸濁させる。すべての細胞懸濁液を滅菌済みの50 mlチューブに移す。
2. 細胞を500 x gで5分間遠心分離する。各チューブの細胞ペレットを5 mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で再懸濁し、すべての細胞懸濁液を1本の50 mlチューブにまとめる。
3. 細胞を500 x gで5分間遠心分離し、上清を除去する。この段階で、細胞ペレットを-で保存する。80 °C または、ステップ2.4～2.15に記載されている手順に従い、ペレットから直ちにAAVを精製します。
4. 溶解バッファーを調製する：150 mM 塩化ナトリウム (NaCl) および 20 mM Tris(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩 (Tris-HCl, pH 8.0)。フィルター滅菌を行う（0.22 µM）。バッファーは以下で保存してください。 4 °C.
5. ペレットを10 mlの溶解バッファーで再懸濁します。
6. 溶解物を-で凍結させます。80 °C またはドライアイス/エタノールバス中で保持し、その後、以下の温度で解凍する 37 °C1分間ボルテックス処理する。溶解物を3回凍結・融解させる。
7. 塩化マグネシウム (MgCl2) を添加します。₂）溶液を融解したライセートに加える（最終濃度をMgCl2 ...にする）₂（溶解液中の濃度を1 mMにする）。ヌクレアーゼを最終濃度250 U/mlになるように添加する。以下でインキュベートする。 37 °C DNA/タンパク質の凝集を溶解させるため、15分間静置する。
  注：ヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ処理後もDNA/タンパク質の凝集が解消されない場合は、溶解物をダウンスホモジナイザーで20回均質化してください。
8. サンプルを4,800 x gで20分間、以下で遠心分離します。 4 °C上清を回収する。
9. その間に、ヨジキサノール密度勾配溶液を調製します。
  1. 10倍PBS 5 mlと1 M MgCl2 0.05 mlを混合し、17%の勾配溶液を調製します。₂、1 M 塩化カリウム (KCl) 0.125 ml、5 M NaCl 10 ml、および密度勾配培地 12.5 ml。H2Oを用いて全量を50 mlに調整する。₂O.
  2. 10倍PBS 5 mlと1 M MgCl2 0.05 mlを混合し、25%溶液を調製します。₂、1 M KCl 0.125 ml、密度勾配媒体 20 ml、および0.5% (w/v) フェノールレッド 0.2 mlを加える。H₂Oを用いて全量を50 mlに調整する。₂O.
  3. 10倍PBS 5 mlと1 M MgCl2 0.05 mlを混合し、40%溶液を調製します。₂、1 M KClを0.125 ml、密度勾配培地を33.3 ml加える。H2Oを用いて全量を50 mlに調整する。₂O.
  4. 1 M MgCl2 0.05 mlを混合し、60%溶液を調製します。₂1 M KCl 0.125 ml、密度勾配培地 50 ml、および 0.5% (w/v) フェノールレッド 0.1 ml。
10. 針とシリンジを用いて、ポリプロピレンチューブに下層から順に、17%溶液 5 ml、25%溶液 5 ml、40%溶液 5 ml、60%溶液 5 mlの順でヨジキサノール密度勾配溶液を充填する。ステップ3.8で得られたすべての溶解液（14～16 ml）を勾配の上層に加える。これにより、下から上に向かって60%、40%、25%、17%、および溶解液層という勾配が形成される。チューブの残りの部分を溶解バッファーで満たし、コルクで蓋をする。
11. 185,000 x gで90分間遠心分離し、 16 °C.
12. シリンジを用いてウイルス画分（40%層）を回収する。針（21ゲージ）を40%画分と60%画分の境界に挿入し、40%層のみを吸引する。
  注意： 25%層を吸引しないようにしてください。
13. ウイルス分画を、滅菌済みのポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロック共重合体PBS溶液（10% ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロック共重合体ストック溶液をPBSで1:10,000に希釈したもの）と混ぜ合わせ、全量を15 mlにする。この混合液をフィルターチューブ（分画分子量 = 100 kD）に充填する。2,000 x gで30分間、次で遠心分離を行う。 4 °C.
14. 下部の溶液を廃棄する。フィルターチューブにポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロック共重合体PBS溶液を加え、全量を15 mlにする。2,000 x gで20分間遠心分離する。 4 °Cこの手順をさらに2回繰り返します。精製されたrAAV9ウイルス（フィルター上の分画）を回収します。
15. フィルターチューブ内の精製rAAV9を1.7mLチューブに移す。精製rAAV9を分注する（100 - 400 µl/tube（AAVの量およびタイターに応じて）添加し、ウイルスを-で保存する80 °C.
  注意： 凍結融解の繰り返しを避けてください。

名前	会社	カタログ番号
ポリエチレンイミン、リニア (MW 25,000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
ポリプロピレンチューブ、36.2 ml, 25 x 87 mm, (qty. 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
ヌクレアーゼ、超純品	SIGMA	#E8263-25KU
密度勾配媒体(Iodixanol)	SIGMA	#D1556-250ML
Ultracel-100膜付き遠心ろ過ユニット	EMD Millipore Corporation	#UFC910008
実験用ピペッティングニードル、90°鈍端、ゲージ14, L 6 in., ニッケルメッキハブ	SIGMA	#CAD7942-12EA
ポロキサマー188溶液 (Pluronic® F-68溶液)	SIGMA	P5556-100ML
プロテイナーゼK	SIGMA	3115828001
DNase I	Roche	10104159001
遠心分離機	Thermo Scientific	75004260
遠心分離システム	Beckman Coulter	363118
超遠心機	Beckman Coulter
DMEM培地	Fisher Scientific	SH30243FS
ウシ胎児血清	Atlanta Biologicals	S11150
rAAV9ベクター	Penn Vector Core	P1967

導入済みヒト腎細胞からのリコンビナントウイルス粒子の精製

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