乳頭腫ウイルスE6およびE7遺伝子による血管内皮細胞（EC）の導入 注：一次ECの培養には通常、標準的な組織培養フラスコを使用する。しかし、ECの増殖が不十分な場合は、市販の培養フラスコの使用を検討すべきである。 一次ヒト真皮微小血管内皮細胞またはリンパ管内皮細胞を、EC増殖培地（EGM；EC基底培地［EBM］にEGM-2 BulletKit［胎児牛血清、ヒドロコルチゾン、ヒト線維芽細胞増殖因子-B、血管内皮細胞増殖因子、インスリン様増殖因子-1、アスコルビン酸、ヒト上皮細胞増殖因子、抗生物質、およびヘパリンを含む］を添加したもの）を用いて、T75細胞培養フラスコ内で、37 °C、5% CO2の加湿インキュベーターにて、コンフルエンスが約50%になるまで培養する。 導入のため、PA317 LXSN 16E6E7細胞を、10%胎児牛血清および抗微生物剤を添加したDulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 中で、T150細胞培養フラスコを用いて、37 °C、5% CO2の加湿インキュベーターにて、コンフルエンスが約90%になるまで培養する。その後、16 mLの培地中で一晩インキュベートする。 PA317培地を、室温で300 × gで5分間遠心分離して清澄化する。 EC培養液からEGMを取り除き、細胞に12 mLの清澄化したPA317培地を重層させ、4時間インキュベートする。 注：16 mLの条件化培地を300 × gで5分間遠心分離するとコンパクトなペレットが形成されるため、その後の12 mLの清澄上清の慎重な回収によって撹乱されることはない。ただし、PA317 LXSN 16E6E7細胞の一次EC培養への混入が懸念される場合（パッケージング細胞株がECよりも急速に増殖するため）、転移前に条件化上清を0.45 µmフィルターでろ過することができる。 PA317培地の6 mLを新鮮なEGMに置換し、一晩インキュベートする。 ECに12 mLの新鮮なEGMを再添加し、さらに48時間インキュベートする。 ECを継代するには、培地を除去してカチオン不含のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）12 mLで洗浄し、市販の酵素解離液（例：TrypLE）3 mLを加えて37 °Cで3分間インキュベートする。 細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、室温で300 × gで5分間遠心分離する。得られた細胞ペレットを新鮮なEGMで再懸濁し、1フラスコあたり最終容量12 mLのEGMとなるように、3本のT75フラスコに等量ずつ分注する。 E6およびE7が導入されたECを選別するため、G418を最終濃度200 µg/mLで2継代分添加する。その後、導入されたECを感染用プレートに播種するか、液体窒素中で凍結保存することができる。 McAllister, S. C., Hanson, R. S., 他 カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスによる細胞形質転換を研究するためのインビトロモデル J. Vis. Exp.(2017)
このビデオでは、HPV16 E6/E7オンコジーンを用いた初代内皮細胞のレトロウイルス導入について解説します。統合されたオンコジーンは腫瘍抑制因子であるp53およびRbを不活性化し、細胞の寿命を延長させます。G418による選択を行うことで導入細胞を濃縮し、形質転換研究に適した不死化内皮細胞培養株を得ることができます。
