この動画では、ウイルス感染細胞内のウイルスRNAを可視化するための蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）について解説します。プローブのハイブリダイゼーション、信号増幅、および共焦点イメージングに至るまでの一連の手順について説明します。
方法論記事
蛍光in situハイブリダイゼーションによる宿主細胞内におけるウイルスRNA分布の決定
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2026年8月31日
この記事について
要約
プロトコル
1. ウイルスRNAの固定、ハイブリダイゼーションおよび可視化
- 培地と過剰な細胞を除去する。本プロトコル全体を通して、溶液の除去には吸引を、溶液の添加には穏やかなマイクロピペッティングを用いる。
注意：吸引の強さは、ガラス製パステールピペットの上に20 µLマイクロピペートチップを配置することで低減できる。コンタミネーションを防ぐため、洗浄ステップごとにマイクロピペートチップを交換すること。細胞を絶対に乾燥させてはならないため、各洗浄ステップは迅速に行う必要がある。 - 直ちに、氷上で冷却した4% ホルムアルデヒド/PBS（リン酸緩衝生理食塩水）を用いて、細胞を氷上で30分間固定する。4 °Cに冷却した20 µL 1x PBSで細胞を3回洗浄し、室温または氷上で5分間インキュベートする。
- 固定した細胞を、氷上で冷却した20 µL 0.5% Triton-X/PBSで10分間、または4 °Cで冷却した750 µL 70% エタノールで1時間（最小）から7日間（最大）処理して透過化させる。
注意：特に指定がない限り、本プロトコルのすべての洗浄は同様の方法で行う。70% エタノールはチャンバーとスライド間の接着剤を緩めるため、後の分離が容易になり、またプロトコルの中で十分な休止時間を設けることができる。それでも、蒸発を抑えるためにチャンバースライドの周囲にパラフィンフィルムを使用し、約8時間ごとに各チャンバーのエタノールレベルを確認すること。また、70% エタノールは細胞を平坦化させるため、より鮮明な画像が得られる一方、Triton-Xは細胞を脱水させないため、細胞の寸法は変化しない。
- 固定した細胞を、氷上で冷却した20 µL 0.5% Triton-X/PBSで10分間、または4 °Cで冷却した750 µL 70% エタノールで1時間（最小）から7日間（最大）処理して透過化させる。
- スライドにひびが入るのを防ぐため、慎重にチャンバーを取り除く。
注意：メーカー提供の新しい取り外し器具か、残留接着剤が極めて少ないものを使用し、スライドが割れないようにゆっくりとチャンバーを外す。透過化試薬として70% エタノールを4時間使用すると、ひび割れの可能性を大幅に低減できる。ひびが入った場合は、影響を受けていないチャンバーでプロトコルを継続し、不完全に密閉されたスライドは酸化速度が高くなる（すなわち保存期間が短くなる）ことに留意すること。 - 細胞を2x SSC（塩化ナトリウムシトレート緩衝液）で1回洗浄し、次に、50% ホルムアミド、10% デキストラン硫酸、2x SSC、0.1% 牛血清アルブミン (BSA)、50 µg/mL 鮭精子デオキシリボ核酸 (DNA)、125 µg/mL E. coli 転移RNA (tRNA)、および1 mM バナジルリボヌクレオシド錯体からなるハイブリダイゼーション溶液 45 µLを添加する。湿潤させた滅菌ワイプを入れた150 mmペトリ皿などの湿室にて、37 °Cで1時間インキュベートする。
注意：ハイブリダイゼーション溶液は、使用の少なくとも1時間前に調製すること。デキストラン硫酸は、頻繁にボルテックスしながら水に溶解させ、37 °Cのウォーターバスでインキュベートする。 - チャンバーあたりのハイブリダイゼーション溶液 35 µLにおいて、推奨濃度25 µMを達成するために必要なオリゴヌクレオチド量を算出する。必要に応じてアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度を調整する。蒸留水をオリゴヌクレオチドに加えて、変性液の容量を10 µLにする。
注意：標識反応後、オリゴヌクレオチドは、0.18 M カコジル酸カリウム、23 mM Tris-HCl、0.23 mg/mL BSA、4.5 mM CoCl2、18 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、2.7 mM リン酸カリウム、6.8 mM KCl、45 µM 2-メルカプトエタノール、0.02% Triton X-10、および2% グリセリンを含むクエンチ溶液中に保存されている。これらの濃度は十分に高いため、水で希釈することで変性溶液を標準的なオリゴヌクレオチド変性バッファーである1x TE (10 mM Tris-HCl および 1 mM EDTA) に近い濃度にできる。 - ジゴキシゲニン (DIG) および/または Alexa Fluor 594で標識したオリゴヌクレオチドを95 °Cで5分間変性させる。その後、変性したオリゴヌクレオチドに、予定しているチャンバーあたり35 µLの新鮮なハイブリダイゼーション溶液を加える。ダブル蛍光in situハイブリダイゼーション (FISH) を行う場合は、両方のアンチセンスオリゴヌクレオチドセットをまとめて変性させ、ハイブリダイゼーションさせてもよい。
- 前ハイブリダイゼーション溶液を除去し、標識オリゴヌクレオチドを含むハイブリダイゼーション溶液を細胞に添加する。フルオロフォア標識オリゴヌクレオチドを保護するため、アルミ箔を被せて、湿室にて37 °Cで一晩インキュベートする。
注意：インキュベーション時間は、最低10時間、最大24時間とする。 - 翌日、細胞を37 °Cで2x SSCを用いて10分間2回洗浄し、次に25 °Cで1x SSCを用いて10分間2回洗浄する。
- 氷上で冷却した4% ホルムアルデヒド/1x PBSを用いて、細胞を氷上で10～15分間固定する。その後、細胞をPBSで3回洗浄し、氷上で冷却した70% エタノールで1時間、または4 °Cで冷却した0.5% Triton-X/1x PBSで10分間処理して透過化させる。
- 氷上で冷却した0.1% BSA/1x PBS中で、1:20に希釈した抗ジゴキシゲニン (DIG)–フルオレセインイソチアニル酸 (FITC) とともに、細胞を4 °Cで1時間インキュベートする。抗体溶液を除去し、1x PBSで3回洗浄する。
- 氷上で冷却した4% ホルムアルデヒド/1x PBSを用いて4 °Cで10～15分間固定し、その後1x PBSで3回洗浄する。
- 氷上で冷却した0.5% Triton-X/1x PBS中の0.4 µg/mL 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) とともに、細胞を氷上で15分間インキュベートし、その後1x PBSで3回洗浄する。
- 蛍光ビーズ（オプション）と封入剤を用いてスライドを封入する。その後、透明のネイルポリッシュでカバーガラスをスライドに密閉する。
- 共焦点顕微鏡を用いて、プロトコルの実施後1時間から1週間以内に、630倍の倍率でサンプルの画像を収集する。カバーガラスを密閉し、酸化速度を抑えてフルオロフォアの寿命を延ばすために、ネイルポリッシュを重ね塗りする。
注意：DAPI含有封入剤は使用しないこと。画像を収集する際は、後の定量化のために各画像にスケールバーを入れること。蛍光ビーズは、スライド間およびサンプル調製間の蛍光強度のコントロールとして機能する。二次元 (2D) 定量化のために、細胞の中央断面で画像を取得する。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 20-092-156 | |
| デキストラン硫酸 | Sigma Aldrich | D8906 | 分子生物学グレード |
| DIG-オリゴヌクレオチド・テイルリングキット | Sigma Roche | #0353583910 | 第2世代 |
| 8チャンバースライド | Nunc Lab Tek II | #15453 | ブルーシールは表面張力を高めるが、クリアゲルによる分離タイプも利用可能。 |
| ホルムアミド | Sigma Aldrich | F9037 | 分子生物学グレード |
| バナジルリボヌクレオシド複合体 | NEB | S1402S |
