自然誘導の経時的な直接計数（図1） 1.1 ライソジェン（例：LES（Liverpool Epidemic Strain (LES) バクテリオファージ）を保有するP. aeruginosa PAO1 ライソジェン）および指示宿主（PAO1-RifR（リファンピシン耐性Pseudomonas aeruginosa PAO1））の単一コロニーを5 mLのLB（Luria–Bertani 液体培地）に接種し、37 °C、180 rpmの振盪条件下で一晩（18～24時間）培養して、スターター培養液を調製する。 1.2 一晩培養したライソジェンおよび指示宿主の培養液を、10 mLのLBに1:10の割合で接種して新鮮な培養液を調製し、37 °C、振盪（180 rpm）条件下で培養する。 1.3 OD60の測定およびMiles Misra法による生存菌数測定を行い、ライソジェンの増殖をモニターする。具体的には、接種時から8時間にわたり、1時間ごとに各ライソジェン培養液から1 mLのサンプルを採取する。 1.4 サンプル採取後直ちに、10 µLのサンプルを90 µLの各培地に加えて段階希釈を行う。最大速度で十分にボルテックスし、希釈ごとにチップを廃棄しながら、10⁻¹から10⁻⁹まで希釈系列を調製する。 1.5 必要となる希釈液を10 µLずつLB寒天平板に3連でスポットし、乾燥させた後、37 °Cで18～24時間培養する。 1.6 生存細菌数を算出するため、コロニーの計数が容易な希釈倍率を選定する。各スポットのコロニー数を数え、以下の計算式を用いる。 注：ライソジェン培養液の増殖に伴い、自然誘導によって活性ファージ粒子が産生される。感染性ファージが産生されるということは、ライソジェン集団のトランスクリプトームに、溶菌性ファージの複製シグナルおよびそれに対応する宿主細胞の反応による、溶菌複製サイクルに関連した遺伝子発現が混入することを意味する。したがって、データセットにおけるバックグラウンドの転写ノイズ（溶菌性ファージのトランスクリプトームによって生成されるもの）を可能な限り抑えるため、遊離感染性ファージ粒子に対するライソジェン細胞の割合が最大となる増殖段階を特定することが重要である。 1.7 各時点のサンプルにおける感染性ファージ粒子を計数するため、適切な選択剤（PAO1宿主のMICはわずか16 µg·mL⁻¹であるため、本例では50 µg·mL⁻¹のリファンピシン）の存在下で、対数増殖期中期にある指示宿主（OD600: 0.4–0.5、本例ではPAO1-RifR）10 µLを、5 mLの滅菌済み0.4% LB細菌用寒天（トップアガー）に接種する。 1.8 同様の段階希釈液（ステップ1.2.2参照）を10 µLずつ接種済みのトップアガー層にスポットし、乾燥させた後、37 °Cで18～24時間培養する。 1.9 感染性ファージ粒子数を算出するため、プラークの計数が容易な希釈倍率を選定する。各スポットのプラーク数を数える。以降の実験ステップに向けて、CFU（コロニー形成単位）あたりの自然誘導が最小となる時間または条件を決定する。 Krishnamurthi, R., 他 トランスクリプトーム解析による温和性バクテリオファージがそのライソゲンに及ぼす影響の理解 J. Vis. Exp. (2024).
このビデオでは、生存細菌細胞数（CFU）と感染性ファージ粒子数（PFU）を経時的に定量することで、溶原性Pseudomonas aeruginosaにおける自発的なファージ誘導の経時的な計数法を実演します。増殖中の定義された間隔でサンプリングを行い、コロニー形成とプラーク形成の両方を分析することで、自発的な誘導が最小となる時期を明らかにします。これにより、溶菌性の干渉を最小限に抑えた、その後のトランスクリプトーム解析に最適な時点を特定することが可能になります。
