1. RNA（リボ核酸）抽出用非誘導および誘導ライソゲン培養液の調製 1.1. ライソゲンの単一コロニーを5 mLのLB培地に接種して新鮮なオーバーナイト培養を行い、37 °Cで振盪（180 rpm（毎分回転数））しながら18〜24時間培養する。 1.2. オーバーナイト培養液を、8つの250 mLフラスコに分注し、LB（ライソゲニーブロス）を用いて1:100の比率で継代培養する。 1.3. 1つ目のフラスコに「非誘導」とラベルを貼り、他のフラスコには「誘導」および各サンプルの回収時間（例：「誘導 t = 0」、「誘導 t = 10分」、「誘導 t = 20分」など）を記載する（図1）。 1.4. 培養開始から90分後、OD（光学密度）600が0.1〜0.2の間になったとき、または最小の自発的誘導が起こるタイミング（考察を参照）で、非誘導フラスコに1%氷酢酸（v/v）を4 µL添加する（図1）。 注：本研究における誘導剤は1%氷酢酸を溶媒として調製したため、コントロールステップとして同量の溶媒のみを添加した。異なる誘導剤を調製する場合は、別のコントロールを検討すること。 1.5. 非誘導フラスコの培養液80 mLを720 mLの滅菌LB培地に加え、直ちに停止液（氷冷5% [v/v] フェノール、pH 4.3、95% [v/v] エタノール）を培養液量の20%（160 mL）の量で添加し、氷上で最低30分から最長2時間まで静置してRNA転写物を安定化させる。これが非誘導サンプルとなる。 1.6. 残りの7つの250 mLフラスコの培養液（図1）に、適切な誘導剤のFMIC（最終最小発育阻止濃度）（本例では、1%氷酢酸 [w/v] で調製し、最終濃度1 µg·mL⁻1で使用した25 mg·mL⁻¹ ノルフロキサシン）を加え、よく混ぜて、37 °Cで180 rpmで振盪しながら1時間培養する。 注：このステップにより、ライソゲン培養液をより同調した溶菌的複製状態へと導く。培養液内のほとんどの細胞で、感染性ファージ粒子の溶菌的産生が開始される。 1.7. 誘導フラスコの培養液80 mLを720 mLの滅菌LB培地に加えることで誘導剤を効果的に希釈し、細胞を回復させる。ステップ1.5で述べたように、停止液を添加して、0分から1時間まで10分ごとに各フラスコから細菌細胞を回収する。 注：停止液はRNAを最大2時間まで安定化させる。ただし、サンプルの安定性を高めるため、以降のすべての操作は4 °Cで行う。 1.8. RNA分解を避けるため、処理後2時間を超えないうちに、可能な限り速やかに4 °Cで10,000 x g、15分間遠心分離して回収する。 1.9. 上清を廃棄し、各サンプルを1.5 mLマイクロ centrifugeチューブに移す前に、可変自動ピペットを用いて残液中で細菌ペレットを緩やかに再懸濁する。 1.10. マイクロ centrifugeチューブをマイクロ centrifugeを用い、4 °Cで高速（13,000 x g）で1分間遠心分離し、残った上清を廃棄する。 1.11. 密封した各マイクロ centrifugeチューブを液体窒素に浸し、ペレットを急速凍結させる。これにより、RNA抽出のための効率的な細胞溶解が可能になる。 1.12. 凍結した各ペレットにTRIzol（1 mL）を加え、ピペッティングによって懸濁液を均質化する（ボルテックス処理は行わない）。すべてのサンプルのRNA抽出準備が整うまで、-80 °Cで保存する。 注：この時点でプロトコルを一時中断することができる。 1.13. ステップ1.1〜1.12を、3つの生物学的レプリケートで繰り返す。 Krishnamurthi, R., 他トランスクリプトーム解析による温和性バクテリオファージがそのライソゲンに及ぼす影響の解明 J. Vis. Exp. (2024)
このビデオでは、細菌ゲノムに組み込まれたプロファージにおける溶菌サイクルの誘導と、トランスクリプトーム解析に向けた時間経過サンプリングによる遺伝子発現変化の捕捉について解説します。
