トランスフェクションした哺乳類細胞からのアデノ随伴ウイルスの回収

要約

AAV（アデノ随伴ウイルス）の回収および形質導入したHEK293（ヒト胚性腎細胞293）細胞の化学的溶解 細胞培養チャンバーを激しく揺すり、剥離した細胞で培地が濁るまで細胞を遊離させ、4本の500 mL遠心チューブに注ぎ入れる。4 °Cで18,000 x gにて30分間遠心分離し、細胞をペレット化する。清澄化した上清を1 Lのポリエチレンテレフタレート共重合ポリエステル（PETG）ボトルに注ぎ入れる。 注：高速遠心機が使用できない場合は、12,000 x gで40分間遠心分離する。この回転数では細胞ペレットが凝集しきっていない可能性があり、上清を注ぎ出す際に流出することがある。 細胞ペレットを50 mLの溶解緩衝液とともに500 mL遠心チューブ内で再懸濁し、37 °Cで60分間インキュベートする。18,000 x gで30分間遠心分離し、上清を先ほどの1 L PETGボトルに移す。ペレット化した細胞残渣は廃棄する。 注：清澄化した上清は直ちに精製し、4 °Cで最大72時間まで保存すること。長期保存の場合は-80 °Cで保存する。-20 °Cでの保存は避けること。 Rghei, A. D., 他大型動物モデルを用いた前臨床研究のためのセルスタックによるアデノ随伴ウイルスベクターの製造。 J. Vis. Exp. (2021)

このビデオでは、化学的溶菌と遠心分離を用いて、トランスフェクションされた哺乳類細胞から粗アデノ随伴ウイルスを回収する方法を実演します。これにより、後続の精製工程や前臨床遺伝子治療への応用のための、高収量なAAV製造が可能になります。

プロトコル

1. AAV（アデノ随伴ウイルス）の回収および transfection 後の HEK293（ヒト胚性腎細胞 293）細胞の化学的溶解

1. 細胞培養チャンバーを激しく揺さぶり、剥離した細胞で培地が濁るまで細胞を遊離させ、4本の500 mL遠心チューブに注ぎます。
2. チューブを18,000 x gで30分間、4 °Cで遠心分離し、細胞をペレット化します。清澄化した上清を1 Lポリエチレンテレフタレート共重合体（PETG）ボトルに注ぎます。注意：高速遠心機が使用できない場合は、12,000 x gで40分間遠心分離してください。この回転数では細胞ペレットが凝固せず、上清を注ぎ出す際に流出することがあります。
3. 500 mL遠心チューブ内の細胞ペレットを50 mLの溶解バッファーで再懸濁し、37 °Cで60分間インキュベートします。
4. チューブを18,000 x gで30分間遠心分離し、上清を同じ1 L PETGボトルに移します。ペレット化した細胞残渣は廃棄してください。注意：清澄化した上清は直ちに精製し、4 °Cで最大72時間まで保存してください。長期保存の場合は-80 °Cで保存してください。-20 °Cで保存しないでください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10チャンバーセルスタック	Corning	3271
1L PETGボトル	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1000 mg/L D-glucose, L-glutamine含有	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
ウシ胎児血清 (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
HEK293細胞	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	受領後、メーカーのプロトコルに従って細胞を融解し、培養する。細胞を最小限に継代し、良好に増殖している状態で、分注して一部を凍結保存し、液体窒素中で保存する。継代数は常に30代未満の細胞を使用すること。培養細胞を30回以上継代した場合は、保存した分注サンプルから培養を再開することを推奨する。
大容量遠心管用サポートクッション	Corning	CLS431124	遠心機のローターに適切なV字底クッションが備わっていない場合は、大容量遠心管にサポートクッションを使用する必要がある。
大容量遠心管	Corning	CLS431123-6EA	500 mL遠心管