動物サンプルを用いたすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会の審査および承認を受けている。 透明帯下の1細胞期胚へのレンチウイルスベクターのマイクロインジェクション 注：マイクロインジェクションには、2つの前核が確認できる1細胞期胚を使用すること（図1）。 レンチウイルス（LV）分注液を室温で融解し、10,000 x g、室温（RT）で2分間遠心分離して、残存する細胞碎片をペレット化する。 マイクロインジェクションのセットアップ マイクロフォージを用いて、ガラス製保持ピペット（ホウケイ酸ガラスキャピラリー）を作成する。ガラスキャピラリーを炎で加熱延伸し、5～10 cmのチップを作成する。ピペットを折り、チップを約4 cm残す。外径は約80～120 µmとする。 注：ピペットチップが完全に真っ直ぐで滑らかであることを確認すること。 延伸したピペットをマイクロフォージにセットし、チップを加熱フィラメントの前に配置する。フィラメントをピペットチップのごく近くまで近づけて加熱し、直径が約15 µm（胚のサイズの約20%）になるまで収縮させる。ピペットを加熱フィラメントに対して垂直に、ピペットチップから2～3 mm離れた位置に配置し、加熱を開始する。ガラスが軟化する。15°の角度になるまで加熱する。 ピペットプラーを用いて、フィラメントでマイクロインジェクション用ホウケイ酸ガラスキャピラリーを作成する。キャピラリーを延伸チャンバーに挿入する。ランプテストを実行する（新しいガラスを使用する場合の初回、およびフィラメント交換後の毎回）。Heatをランプ値-10、Pullを100、Velocityを150、Timeを100に設定する。 注：最適なインジェクションキャピラリーを得るために、これらのパラメータを調整すること。 バイオセーフティ・ラミナーフローフード内で、マイクロローダーチップを用いて、約2 µLのウイルス溶液をマイクロインジェクションピペットにロードする。 マイクロインジェクション用ディッシュ（60 mmペトリ皿の蓋）に、100 µLのM2培地を（中央に）滴下し、液体パラフィンまたはミネラルオイルで覆って準備する。 ウイルス溶液をロードした保持ピペットとマイクロインジェクションキャピラリーを、倒立顕微鏡下でマイクロマニピュレーターおよびマイクロインジェクションディッシュに取り付ける。 マイクロインジェクションの実施 15～20個の1細胞期胚を、マイクロインジェクションディッシュ上のM2滴に移す。保持ピペットを用いて胚を固定する。 400倍の倍率を用い、自動インジェクターに接続したガラスキャピラリーを使用して、透明帯下の卵周隙にLV溶液を注入する。キャピラリーを透明帯下に一瞬保持する。 注：緩やかな正圧を用いることで、ウイルス溶液がインジェクションキャピラリーから連続的に流出するが、送り出される懸濁液の量を制御することはできない。 微細ピペットを用いて、胚を37 °C、5% CO2雰囲気下のインキュベーター内にある培養皿に戻す。1つの接合子あたりの注入回数は変動し、ウイルスベクターの濃度に基づいて調整可能である。 注：注入した胚は、1細胞期のまま代用母体に移植するか、M16培地で一晩（O/N）インキュベートした後に2細胞期で移植することができる。ラット胚の長期間のin vitro培養は避けるべきである。 Koza, P., 他 レンチウイルスベクター法を用いたトランスジェニックラットの作製 J. Vis. Exp. (2020)
このビデオでは、形質転換ラットを作製するための安定的な外来遺伝子組み込みを実現するため、受精ラット胚へのレンチウイルスベクターのマイクロインジェクションによる導入法を解説します。
