アフィニティークロマトグラフィーを用いたウイルスインテグラーゼの精製

要約

ニッケルアフィニティークロマトグラフィー 細菌ペレット1つ分を氷上で解凍する。 注：この操作にはかなりの時間（約2〜3時間）を要する。ペレットが細胞懸濁液状に解凍されたら、さらに500 μMのフェニルメチルスルホニルフッ化物（PMSF）（100 mMストック溶液）を添加する。 細菌懸濁液を入れた50 mLチューブを氷上に保持する。直径0.5インチのバイオホーンと直径0.125インチのテーパーマイクロチップを備え、周波数20 kHz、最大出力400 Wのソニケーターを用い、1 L培養由来のペレット1つにつき、振幅30%で30秒間（1秒オン、1秒オフ）ソニケーションを行う。 細胞試料を冷やした超遠心管に移す。Type 60 Ti固定角ローターに対応したポリカーボネート製ボトルアセンブリ（直径25 mm、高さ89 mm）を使用する。同等の重力加速度が得られる場合は、別のチューブやローターを使用してもよい。4 °Cで120,000 x gにて60分間遠心分離を行う。明瞭なペレットが形成されているはずである。上澄み液は黄色を呈する場合がある。 上澄み液を注ぐかピペッティングにより、冷やした50 mLコニカルチューブに移す。液量を記録する。この液量は、急冷前に使用した再懸濁バッファーの量とほぼ等しくなるはずである。上澄み液に粘性がある場合は、細菌DNAが混入しており、クロマトグラフィーカラムを詰まらせる可能性がある。その場合は、超遠心分離を繰り返して細菌DNAをペレット化させる。 バッファーA（50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF）500 mLおよびバッファーB（50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM イミダゾール）500 mLを調製する。 注：本プロトコルでは、高速液体クロマトグラフィー（FPLC）システム、すべてのバッファー、および試料を、コールドルーム内の4 °Cに保持すること。 0.2 μmの使い捨てフィルターユニットを用いて、バッファーAおよびBを滅菌ろ過する。FPLCシステムに応じて、ポンプAをバッファーAで、ポンプBをバッファーBでそれぞれ洗浄する。導電率と紫外線（UV）吸収値が安定するまで、90%バッファーAおよび10%バッファーBをシステムに流す。最大流速は装置に依存するが、流速5 mL/min、最大圧力制限1.0 MPaで使用する。 長さ110 mm、直径5 mmのFPLCカラムに、1.5 mLのニッケルチャージ樹脂（最大結合能 50 mg/mL、最大圧力 1 MPa）を充填して準備する。カラムは精製前日に準備し、4 °Cで保存してもよい。 カラムをFPLC装置に接続する。流速0.5 mL/min、最大圧力制限0.5 MPaで、90%バッファーAおよび10%バッファーB（20 mM イミダゾール）20 mLを用いてカラムを平衡化する。装置で、導電率および280 nmにおけるUV吸収度（A280）のリアルタイムデータを収集する。導電率とUV値が安定するはずである。これらの値が安定しない場合は、安定するまでバッファーをカラムに流し続ける。 タンパク質試料（ペレット1つにつき約10 mL）を、流速0.15 mL/min、最大圧力制限0.5 MPaでカラムにロードする。流速とカラム圧力は精製を通して一定に保持する。フロースルーを50 mLチューブに回収する。 90%バッファーAおよび10%バッファーB 20 mLでカラムを洗浄する。洗浄液を50 mLチューブに回収する。10%から100%バッファーB（20 mMから200 mM イミダゾール）の20 mL線形勾配を用いてタンパク質を溶出させる。 最後に、100%バッファーB（200 mM イミダゾール）5 mLでカラムを洗浄する。グラジエント分画および最終洗浄液を0.27 mLずつ分画して回収する。 2x SDS-PAGEサンプルバッファー15 μLを、フロースルー、洗浄液、およびA280ピーク分画のそれぞれ15 μLに混合する。試料を3分間沸騰させる。 10% SDS-PAGEゲルを2枚準備する。各試料10 μLおよびプレステインタンパク質標準 4 μLをゲルにロードする。電気泳動を行い、染色して分析する。 目視検査に基づき、ほぼ純粋なプロトタイプ泡沫ウイルスインテグラーゼ（PFV IN）が含まれていると考えられる分画を回収して合わせる。ピペッティングにより液量を測定する（通常 8〜10 mL）。 分光光度計を用いて、合わせた分画のA280を測定し、PFV INタンパク質の総量を算出する。典型的な収量は、誘導培養液1リットルあたり約10 mgである。ヘキサヒスチジンタグ付きPFV INの消衰係数は 59360 cm⁻¹ M⁻¹ である。 Lopez Jr., M. A., ら組換えプロトタイプフォーミーウイルスインテグラーゼの精製過程におけるヌクレアーゼ混入の検出および除去 J. Vis. Exp. (2017)

このビデオでは、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いたポリヒスチジンタグ付きウイルスインテグラーゼの精製方法を説明します。このプロトコルでは、ニッケル充填レジンに対する親和性に基づいてインテグラーゼを選択的に単離するため、イミダゾール勾配溶出を用います。

プロトコル

1. ニッケルアフィニティクロマトグラフィー

1. 細菌ペレット1個分を氷上で融解させる。
   注意：これにはかなりの時間（約2～3時間）を要する。ペレットが細胞スラリー状に融解したら、さらに500 μMのフェニルメチルスルホニルフッ化物（PMSF）（100 mMストック溶液）を添加する。
2. 細菌スラリーの50 mLチューブを氷上に保持する。直径0.5インチのバイオホーンと直径0.125インチのテーパーマイクロチップを備え、周波数20 kHz、最大出力400 Wのソニケーターを使用し、1 L培養分から得られたペレット1個につき、振幅30%で30秒間（1秒オン、1秒オフ）超音波処理を行う。
3. 細胞サンプルを冷却した超遠心管に移す。Type 60 Ti固定角ローターに対応したポリカーボネート製ボトルアセンブリ（直径25 mm、高さ89 mm）を使用する。同等の重力加速度が得られる場合は、別のチューブやローターを使用してもよい。4 °Cで120,000 x g、60分間遠心分離する。明確なペレットが形成されているはずである。上清は黄色を呈する場合がある。
4. 上清を注ぐかピペッティングにより、冷却した50 mLコニカルチューブに移す。液量を記録する。この液量は、急速凍結前に使用した再懸濁バッファーの量とおおよそ一致するはずである。上清に粘性がある場合は、細菌由来のDNAが混入しており、クロマトグラフィーカラムを詰まらせる可能性がある。その場合は、超遠心分離を繰り返し、細菌DNAをペレット化させる。
5. Buffer A（50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF）を500 mL、およびBuffer B（50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM imidazole）を500 mL調製する。
   注意：本プロトコルでは、高速液体クロマトグラフィー（FPLC）システム、すべてのバッファー、およびサンプルを、コールドルーム内の4 °Cに保持すること。
   1. 0.2 μm使い捨てフィルターユニットを用いてBuffer AおよびBをろ過滅菌する。FPLCシステムに応じて、ポンプAをBuffer Aで、ポンプBをBuffer Bでそれぞれ洗浄する。導電率と紫外線（UV）吸収値が安定するまで、90% Buffer Aと10% Buffer Bをシステムに流す。最大流量は装置によって異なる。流量5 mL/min、最大圧力制限1.0 MPaで使用する。
6. 長さ110 mm、直径5 mmのFPLCカラムに、1.5 mLのニッケル担持樹脂（最大結合容量50 mg/mL、最大圧力1 MPa）を充填して調製する。カラムは精製の前日に調製し、4 ˚Cで保存することができる。
7. カラムをFPLC装置に接続する。流量0.5 mL/min、最大圧力制限0.5 MPaで、90% Buffer Aと10% Buffer B（20 mM imidazole）20 mLを用いてカラムを平衡化する。装置で、導電率および280 nmでのUV吸収度（A₂₈₀）のリアルタイムデータを収集する。導電率とUVの値が安定するはずである。これらの値が安定しない場合は、安定するまでバッファーをカラムに流し続ける。
8. タンパク質サンプル（ペレット1個あたり約10 mL）を、流量0.15 mL/min、最大圧力制限0.5 MPaでカラムにロードする。流量およびカラム圧力は精製の間ずっと一定に維持する。通り抜け液（フロースルー）を50 mLチューブに回収する。
   1. 90% Buffer Aと10% Buffer Bを20 mL流してカラムを洗浄する。洗浄液を50 mLチューブに回収する。10%から100% Buffer B（20 mMから200 mM imidazole）の20 mL線形勾配を用いてタンパク質を溶出させる。
   2. 最後に、100% Buffer B（200 mM imidazole）5 mLでカラムを洗浄する。勾配溶出液および最終洗浄液を0.27 mLずつの分画として回収する。
9. 2x SDS-PAGEサンプルバッファー15 μLを、フロースルー、洗浄液、およびピークA₂₈₀分画のそれぞれ15 μLと混合する。サンプルを3分間煮沸する。
   1. 10% SDS-PAGEゲルを2枚調製する。各サンプル10 μLをゲルにロードし、プレステインタンパク質スタンダードを4 μLロードする。電気泳動を行い、染色してゲルを解析する。
   2. 目視確認に基づき、ほぼ純粋なプロトタイプフォーミーウイルスインテグラーゼ（PFV IN）が含まれていると思われる分画を回収して合わせる。ピペッティングにより液量を測定する（通常8～10 mL）。
   3. 分光光度計を用い、合わせた分画のA₂₈₀を測定してPFV INタンパク質の全量を算出する。標準的な収量は、誘導培養液1リットルあたり約10 mgである。ヘキサヒスチジンタグ付きPFV INの吸光係数は59360 cm^-1 M^-1である。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BL21/DE3 Rosetta E. coli	EMD Millipore	70956-4
イミダゾール	Sigma-Aldrich	I0250
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430