ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー バッファーC（50 mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩 (Tris-HCl), pH 7.5, 10 mM ジチオスレイトール (DTT), 0.1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA), 500 μM フェニルメチルスルホニルフッ化物 (PMSF)）を250 mL、およびバッファーD（50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl）を250 mL調製する。 注意：本プロトコルでは、高速液体クロマトグラフィー (FPLC) システム、バッファー、およびサンプルは4 °Cの低温室で保持する。 0.2 μmの使い捨てフィルターユニットを用いて、バッファーCおよびDを滅菌ろ過する。FPLCシステムに応じて、ポンプAをバッファーCで、ポンプBをバッファーDでそれぞれ洗浄する。導電率および紫外（UV）吸収値が安定するまで、バッファーC 80%およびバッファーD 20%の混合液をシステムに流す。最大流速は装置によって異なるが、通常は流速5 mL/min、最大圧力制限1.0 MPaで使用する。 1 mLのヘパリンSepharoseレジン（最大結合容量：レジン1 mLあたりウシ抗トロンビンIII 2.0 mg、最大圧力 1.4 MPa）を用いて、長さ80 mm、直径5 mmのFPLCカラムを調製する。カラムは精製の前日に調製し、4 °Cで保存することができる。カラムをFPLC装置に接続する。 流速0.5 mL/min、最大圧力制限1 MPaで、80%バッファーCおよび20%バッファーD（200 mM NaCl）を20 mL流し、カラムを平衡化する。装置で、導電率および280 nmにおける紫外吸光度（A280）のリアルタイムデータを収集する。導電率およびUV値が安定することを確認する。値が安定しない場合は、安定するまでバッファーを流し続ける。 プロトタイプ泡沫ウイルスインテグラーゼ (PFV IN) サンプルに1.5容量分のバッファーCを加え、NaCl濃度を200 mMに低減させる。例えば、10 mLのPFV INに15 mLのバッファーCを加える。全量は通常約25 mLとなる。 希釈したPFV INサンプルを、流速0.5 mL/min、最大圧力制限1.0 MPaでヘパリンSepharoseカラムにロードする。流速およびカラム圧力は、精製工程を通じて一定に保つ。フロースルーは50 mLコニカルチューブに回収する。 80%バッファーCおよび20%バッファーD（200 mM NaCl）20 mLでカラムを洗浄し、洗浄液を50 mLコニカルチューブに回収する。20%から100%のバッファーD（200 mMから1 M NaCl）の30 mL線形勾配を用いて、カラムを溶出させる。 100%バッファーD 5 mLでカラムを洗浄する。勾配溶出液および最終洗浄液を0.37 mLずつのフラクションに分けて回収する。 ロード液、フロースルー、洗浄液、および各フラクションを8%ドデシル硫酸ナトリウム–ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) で分析する。ヘキサヒスチジンタグの切断後、PFV INの分子量は44,394 Daであり、ヘキサヒスチジンタグがない状態での消衰係数は59,360 cm⁻¹ M⁻¹である。すべてのフラクションは、ヌクレアーゼアッセイが完了するまで4 °Cで保存する。 Lopez Jr., M. 他組換えプロトタイプフォーミーウイルスインテグラーゼの精製過程におけるヌクレアーゼ汚染の検出および除去。 J. Vis. Exp. (2017)
このビデオでは、ヘパリンSepharoseカラムクロマトグラフィーを用いて、細菌由来のヌクレアーゼ混入物からウイルスインテグラーゼを精製し、続いてSDS-PAGE分析によってタンパク質の純度を確認する手順を説明します。
