コロナウイルススパイクタンパク質および強化緑色蛍光タンパク質（VSV-S-eGFP）を発現する水疱性口炎ウイルスのタイター測定 1. ウイルスタイター決定のための連続希釈 1. Vero E6細胞を、Dulbecco's Modified Eagle MediumまたはDMEM（10% FBS（胎児牛血清）含有）を用い、播種密度 6 × 10⁵ cells/wellで6ウェルプレートに播種し、37 °C、5% CO₂条件下で一晩インキュベートする。 注：TMPRSS2およびhACE2を過剰発現させたVero細胞も使用可能である。 2. 7本のマイクロ遠心チューブに培地を900 μLずつ分注し、冷やした無血清DMEMを用いてVSV-S-eGFPウイルスの10倍連続希釈系列を作成する。チューブに1から7までの番号を付ける。ウイルスストック液100 μLを1本目のチューブに加え、短時間ボルテックスする。希釈したウイルス液100 μLをチューブ1からチューブ2へ移し、短時間ボルテックスする。この操作をチューブ7まで繰り返す。 3. Vero E6細胞が入った6ウェルプレートの全ウェルから培地を吸引し、10⁵から10⁷の希釈液を500 μLずつ加える。プレートを37 °C、5% CO₂条件下で45分間インキュベートし、15分ごとに緩やかにロッキングする。 4. 接種液を吸引し、2x DMEMと6%カルボキシメチルセルロース（CMC）を1:1で混合したオーバーレイ（最終濃度3% CMC、10% FBS添加）に置き換える。34 °C、5% CO₂条件下で48時間インキュベートする。 注：感染ステップの間、オーバーレイ混合液を37 °Cの恒温水槽で15分間予熱しておく。CMCの代わりに、1%アガロースと10% FBS添加2x DMEMの1:1混合液を使用することもできる。アガロースでオーバーレイする場合、1%アガロース（dH₂O中）を沸騰させ、冷やした2x DMEMと混合する。細胞単層に加える前に、混合液が適切な温度（約37～40 °C）であることを確認する。オーバーレイにアガロースを使用した場合は、染色の前に、3:1のメタノール：酢酸溶液2 mL中で少なくとも1時間インキュベートして細胞を固定させる必要がある。 2. 染色およびウイルスタイターの算出 1. クリスタルバイオレットによる染色、または蛍光顕微鏡によるeGFPの直接観察によりプラークを可視化する。 2. プレートを染色するには、オーバーレイを吸引し、PBSで1回洗浄した後、各ウェルに0.1%クリスタルバイオレット（80%メタノールおよびdH₂O中）を2 mL加える。脱色する前に、室温のプレートロッカースタンド上で約20分間静置する。クリスタルバイオレットを除去し、dH₂OまたはPBSを用いて各ウェルを緩やかに2回洗浄する。 注：手順全体を通じて細胞単層を維持するため、洗浄および染色ステップは、各ウェルの壁に向かってゆっくりとピペッティングし、緩やかに行う必要がある。 3. プラークをカウントする前に、プレートを少なくとも1時間乾燥させる。プラーク数が20から200個の範囲にあるウェルからカウントを行う。1 mLあたりのプラーク形成単位（PFU）でウイルスタイターを算出するには、カウントしたウェルの希釈倍率に感染させた液量を掛け、その値を当該ウェルのプラーク数で割る。 Jamieson, T. R., 他、 擬似ウイルス感染の高スループット蛍光イメージングを用いたSARS-CoV-2中和抗体の検出 J. Vis. Exp. (2021)
このビデオでは、コロナウイルス擬似ウイルス粒子を用いたウイルスプラークアッセイについて解説します。希釈した擬似ウイルスを哺乳類細胞の単層に添加し、メチルセルロースオーバーレイを用いてインキュベートします。感染細胞によって形成されたプラークを目視でカウントし、感染性ウイルス価を決定します。
